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摘要子宫内膜癌(EC,Endometrial carcinoma)为女性常见的恶性肿瘤之一，占女性生殖系统肿瘤的20-30%。近年来子宫内膜癌发病率有升高趋势，其中年轻患者比例明显增加，随着女性生育年龄的延后，尚未生育或仍要求保留生育功能的年轻子宫内膜癌患者逐渐增多。据统计，90%以上的年轻子宫内膜癌患者病变发现多为早期、局限于子宫内膜、组织学类型多为高分化子宫内膜样腺癌且常常伴有子宫内膜不典型增生，其预后较好，使用高效孕激素治疗可保留患者生育功能，临床已有很多成功的报道。前期研究发现：80%以上的年轻早期子宫内膜癌患者孕激素受体(PR, progesterone receptor)表达呈阳性， PR 阳性患者接受孕激素保守治疗时，其中的86.4%可达到完全病理缓解；研究同时发现部分PR阳性的子宫内膜癌患者对孕激素治疗不产生反应，甚至治疗期间出现肿瘤进展，部分PR阴性的患者反而可对孕激素治疗有反应。目前研究并未完全阐明孕激素治疗子宫内膜癌的机制，对子宫内膜癌孕激素耐药的研究尚少，因而进一步探讨孕激素治疗子宫内膜癌的作用机制，寻找预测孕激素治疗效果的分子标记，深入研究孕激素耐药的分子机制，尝试逆转孕激素耐药并增强孕激素治疗效果是非常有必要的。<br>　　细胞自噬(autophagy)是细胞在饥饿、能量缺乏等代谢压力下的一种生理过程，自噬与肿瘤发生发展密切相关。自噬一方面可以促进肿瘤细胞生存，但另一方面，细胞自噬也能抑制肿瘤发生。自噬对肿瘤的作用依赖于肿瘤类型和刺激处理的不同，其具体机制尚未完全研究清楚。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是PI3K/Akt通路的下游分子，临床上以 mTOR 作为抑制靶点进行用药，可产生抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的效果。目前 mTOR 与自噬关系的研究已取得较大进展，通过抑制 mTOR 蛋白的表达，调控自噬活动对临床上肿瘤治疗可能有重要意义。依维莫司（RAD001）是一种口服的mTOR 抑制剂，临床前研究表明其可与细胞毒药物或其他靶向药物同时应用于耐药细胞株并产生抑制细胞生长及促进凋亡的作用，RAD001具有广泛的临床应用前景，现已被批准应用于三阴性乳腺癌患者的药物治疗。本研究将细胞自噬与子宫内膜癌孕激素耐药相结合，研究孕激素耐药机制，以期为子宫内膜癌孕激素耐药患者的治疗探寻到新思路。目的:<br>　　本实验围绕PI3K/AKT/mTOR信号通路调控子宫内膜癌细胞孕激素耐药细胞自噬机制进行研究，主要观察孕激素敏感及耐药的子宫内膜癌细胞中，应用孕激素进行治疗的过程中相关下游通路及重要靶点蛋白的改变，独立用药与联合用药过程中的自噬变化，并应用RNA干扰、microRNA抑制、药物影响、动物荷瘤等多方面实验对子宫内膜癌孕激素耐药细胞的自噬与PI3K/Akt/mTOR通道在其中的作用机制进行探讨，研究药物对于细胞自噬的影响。从抑制 mTOR 等蛋白的表达，诱发自噬方面入手，探索孕激素治疗以及改善孕激素耐药的可行性。为临床上子宫内膜癌孕激素治疗耐药的解决提供方案。<br>　　本研究分为两大部分：体外细胞实验及裸鼠荷瘤实验。<br>　　一：建立细胞模型后进行细胞自噬情况及癌细胞增殖的研究，并应用RNA干扰、microRNA抑制、药物影响等多方面实验对子宫内膜癌孕激素耐药细胞的自噬与PI3K/Akt/mTOR通道在其中的作用机制进行探讨。<br>　　1、建立细胞模型，利用子宫内膜癌Ishikawa细胞及用醋酸甲羟孕酮（MPA）进行耐药处理后产生的孕激素耐药型Ishikawa细胞，进行细胞自噬情况及癌细胞增殖的研究。<br>　　①孕激素耐药子宫内膜癌细胞系的诱导：Ishikawa细胞株采用高浓度MPA长期诱导培养；<br>　　②MTT法检测孕激素敏感Ishikawa细胞及孕激素耐药Ishikawa细胞的在醋酸甲羟孕酮作用下的增殖情况；<br>　　③ Western blot法检测醋酸甲羟孕酮处理后Ishikawa细胞及孕激素耐药Ishikawa细胞中 PR及自噬标志物:LC3B、ATG3 、ATG5等的表达。<br>　　2、对孕激素耐药型的子宫内膜癌细胞中的PI3K/Akt/mTOR通路的激活情况进行研究，并利用此通路中的关键通路分子，对其进行干扰，测定耐药细胞中的蛋白表达情况，推测子宫内膜癌对孕激素产生耐药的分子通路变化及原因。<br>　　① Western blot法检测Ishikawa细胞及孕激素耐药Ishikawa细胞中 PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白: mTOR、pmTOR、AKT、pAKT等的表达情况；<br>　　② 构建AKT干扰质粒后转染细胞，Western blot法检测转染空载细胞及AKT干扰载体细胞中 AKT、pAKT等的表达量差异；MTT法检测转染空载细胞及AKT干扰质粒细胞的增殖情况；Western blot法检测空白载体细胞及AKT干扰细胞中自噬标志物相关蛋白:LC3B、ATG3以及ATG5等的表达差异情况；<br>　　③构建mTOR干扰质粒后转染细胞，Western blot法检测转染空白载体细胞及mTOR干扰载体细胞中 mTOR、pmTOR等的表达； MTT法检测转染空载细胞及mTOR干扰载体细胞的增殖情况； Western blot法检测转染空载细胞及mTOR干扰质粒后细胞中自噬标志物相关蛋白: LC3B、ATG3、 ATG5等的表达差异情况。<br>　　④构建mTOR的突变质粒mut-mTOR，将质粒mut-mTOR、si-mTOR以及空白质粒对照转染进入内膜癌孕激素耐药细胞中，用Westernblot法检测 mTOR蛋白及磷酸化mTOR蛋白表达量的变化情况，MTT测定显示孕激素耐药空白载体细胞、mTOR干扰细胞及mTOR突变细胞的增殖情况;Westernblot测定孕激素耐药空白载体细胞、mTOR干扰细胞及 mTOR突变细胞自噬标记物LC3B，ATG3和ATG5的表达情况。<br>　　3、针对在前面研究中得出的信号通路中mTOR 分子所表现出的重要作用，利用生物信息学相关软件对其进行预测，设计与通路相关的MicroRNA分子，从生物体内小分子调控的方向对信号通路进行研究，以此来对上一歩研究进一步加以验证。<br>　　①预测MicroRNA转染细胞并检测效果，将效果最好的一组进行后续实验。<br>　　②MTT法检测转染MicroRNA后细胞增殖情况。<br>　　③Westernblot法检测MicroRNA转染后对细胞的影响，包括mTOR相关蛋白的表达及细胞自噬情况的变化。<br>　　4、利用mTOR 抑制剂依维莫司（RAD001）处理细胞，检测其对孕激素耐药子宫内膜癌细胞增殖及自噬的影响。<br>　　①Westernblot测定对照组和RAD001组孕激素耐药细胞自噬标志物的表达及 mTOR相关蛋白无磷酸化。<br>　　②MTT 法检测孕激素耐药Ishikawa细胞对照组和RAD001组的增殖情况。<br>　　二：利用裸鼠荷瘤实验，对子宫内膜癌孕激素耐药细胞的自噬与PI3K/Akt/mTOR通道在其中的作用机制进行体内的实验探讨。<br>　　将转染si-mTOR的孕激素耐药型细胞注射裸鼠腋下，观察并测量实验鼠成瘤的结果。于体内进行mTOR蛋白敲减后对瘤体结节影响的相关实验。<br>　　结果：<br>　　1：通过长期MPA诱导建立孕激素耐药的Ishikawa细胞系。MTT结果表明，醋酸甲羟孕酮明显抑制Ishikawa细胞系增殖，但对孕激素耐药细胞的抑制效果则不明显。孕激素耐药的Ishikawa细胞中PR的表达比Ishikawa细胞低。MPA促进Ishikawa细胞的自噬，但对孕激素耐药Ishikawa细胞的自噬没有促进作用。这提示长期孕激素治疗可能导致PR下调和激活其他途径促进细胞生长并抑制子宫内膜癌细胞中的细胞自噬。<br>　　2：MPA可以减少子宫内膜癌Ishikawa细胞中AKT的磷酸化，但孕激素耐药子宫内膜癌Ishikawa细胞株中AKT的磷酸化程度却是增加的。AKT siRNA成功减少细胞中AKT的表达和磷酸化；AKT siRNA使孕激素耐药Ishikawa细胞增殖率降低，并增加了细胞自噬标记物的表达。siRNA敲低孕激素耐药Ishikawa细胞中的mTOR表达，mTOR表达减少后细胞增殖率降低，自噬标记物的表达显著增加。在孕激素耐药细胞中的siRNA识别位点处获得突变的mTOR的表达后mTOR恢复磷酸化，MTT测定显示孕激素耐药细胞恢复增殖，Westernblot显示自噬标记物LC3B，ATG3和ATG5的表达降低。这些结果证实孕激素可刺激PI3K/Akt/mTOR信号通路与自噬活动， PI3K/Akt/mTOR途径对于子宫内膜癌细胞的孕激素耐药是必需的。<br>　　3：运用生物信息学软件对PI3K/Akt/mToR通路中起作用的MicroRNA进行预测，发现miR-29C-3p、miR-142-5p、miR-200a-3p、miR-15a-5p、miR-99a-5p这5种小RNA分子对通路有调控作用，将这5种MicroRNA转染进入细胞进行验证，发现miR-99a-5p对于PI3K/Akt/mToR通路的调节效果最为理想。转染miR-99a-5p后， mTOR的表达量变低，随后的MTT实验也证实转染后细胞增殖速率减慢，蛋白表达得到了敲减，而相对应的通路蛋白LC3B、ATG3和ATG5的表达量都有明显上升，暗示自噬的激活。实验结果提示，从小分子调控方向我们也可以得到一致的结论，即在孕激素耐药型子宫内膜癌细胞中，抑制mTOR分子的表达可以刺激细胞使其自噬活动增多。<br>　　4：依维莫司（RAD001）是mTOR的抑制剂，RAD001显著抑制mTOR的磷酸化， LC3B、ATG3和ATG5的表达均增加。MTT结果显示RAD001组孕激素耐药细胞增殖率降低。这些结果表明RAD001治疗可以通过诱导自噬来抑制孕激素耐药型子宫内膜癌细胞的增殖。<br>　　5：裸鼠瘤体表现为腋下接种部位出现明显结节。对照组接种第 3-8天肉眼均可见瘤体形成，而转染si-mTOR处理组接种 35 天内仅 3只裸鼠成瘤，而且其瘤体的形成时间相对较迟。接种 5 周后，转染si-mTOR处理组结节体积、瘤体质量均明显小于对照组。这些结果表明：体内实验的结果表现出与体外细胞实验结果的一致性，即抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，可以达到抑制肿瘤增殖的效果。<br>　　结论：<br>　　1、醋酸甲羟孕酮（MPA）能够明显抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖，但对于孕激素耐药细胞的抑制效果则不甚明显。MPA促进Ishikawa细胞的自噬，但对孕激素耐药型的Ishikawa细胞无影响。<br>　　2、AKT、mTOR蛋白的表达活性与细胞自噬活动相关，而对应的PI3K/Akt/mTOR信号通路的活动也与细胞自噬关系密切。抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，会使得细胞自噬活动增加，从而对耐药型子宫内膜癌细胞达到增殖抑制的效果。<br>　　3、裸鼠成瘤实验对体外细胞实验进行了验证，即抑制PI3K/Akt/mTOR途径可以达到抑制肿瘤增殖的效果。<br>　　4、抑制PI3K/Akt/mTOR途径可诱导孕激素耐药子宫内膜癌细胞自噬的产生这一理论的建立，为临床治疗孕激素耐药子宫内膜癌寻找到新的思路。