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长链非编码RNA CCAT2在子宫内膜癌细胞中的作用及其机制探究

摘要子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)是常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一,子宫内膜癌多发于绝经期或者绝经后的妇女,在中国子宫内膜癌发病的平均年龄为55岁。近年来,随着我国经济的飞速发展,人们的生活习惯和饮食结构也发生了改变,子宫内膜癌的发病率也逐渐升高,此外、糖尿病、肥胖以及高血压的发生也会使子宫内膜癌的患病机率增加。目前,关于子宫内膜癌的治疗主要是以手术治疗,还有化疗、内分泌治疗以及放疗等加以辅助,尽管研究发现,子宫内膜癌患者早期中5年无病的存活率可高达90%以上,但仍有一些晚期的子宫内膜癌患者会遭受疾病的复发或者死亡,因此,更好地了解子宫内膜癌的发病机制,有助于我们寻找一种更有效的子宫内膜癌治疗策略。<br>  长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是由200多个核苷酸组成的非编码RNA,主要分布在细胞核、细胞质和细胞器中,起初对这些大量的略长的非编码RNA由于缺少功能的注释并没有引起重视。随后研究发现lncRNA能调节生物的生长发育,并且与肿瘤的生成、发展、迁移以及侵袭有密切联系,在某些肿瘤组织中, LncRNA的表达会出现异常,如:lncRNA H19在宫颈癌、前列腺癌、肝癌以及食管癌中表达量明显增加。lncRNA还能影响肿瘤细胞的凋亡和细胞周期。lncRNA可以与靶基因直接作用来抑制或增强靶基因的表达,从而调控基因的表达,还可以成为一种竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)和miRNA进行调控,共同介导靶基因的表达,并且与肿瘤等的发生与发展有密切联系。<br>  lncRNA结肠癌相关转录本2(Colon cancer-associated transcript 2,CCAT2)是Ling等发现的一种lncRNA,该基因中含有与癌症相关的rs6983267 SNP,还有一段高度保守的8q24区域,CCAT2本身在正常的结肠癌组织中表达水平并不高,但是在微卫星稳定(microsatellite stable,MSS)的结肠癌癌症组织中高表达,并且促进肿瘤的生长、迁移和染色体不稳定。除此之外,CCAT2也与宫颈癌、肺癌、食管鳞状细胞癌以及胃癌的发生有关,但是在子宫内膜癌中作用却未见报道。<br>  在肿瘤的形成和发展中,细胞的凋亡会发生异常,细胞凋亡是细胞在一系列信号的刺激下经过信号传导通路,最终导致细胞发生程序性主动死亡的过程。研究发现,B-细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)在恶性肿瘤的形成过程中发挥重要的作用,它能作用于原癌基因,使细胞进一步发生恶化。在淋巴瘤、胃肠道肿瘤以及膀胱癌中都发现,Bcl-2存在过量表达,并且发现过量表达的Bcl-2阻止细胞发生凋亡,使恶性肿瘤不断发展。第10号染色体缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)/磷酯酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT/PKB)与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路在肿瘤的繁殖、凋亡以及侵袭也发挥重要的作用。<br>  目的:<br>  本研究的主要目的是探究lncRNA CCAT2在子宫内膜癌细胞中的作用及其作用机制,首先研究lncRNA CCAT2对子宫内膜癌细胞HEC-1A及RL95-2活力、迁移、侵袭以及凋亡的影响,然后对lncRNA CCAT2与miR-216b在子宫内膜癌细胞中的调控关系进行研究,最后对lncRNA CCAT2与miR-216b在子宫内膜癌中的作用机制进行解析。<br>  方法:<br>  1. lncRNA CCAT2在子宫内膜癌细胞中的作用:首先选取30对子宫内膜癌组织和其对应的非癌组织,并利用实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测CCAT2的表达水平,为进一步研究LncRNA CCAT2的作用,利用shRNA干扰技术降低子宫内膜癌细胞中CCAT2的表达水平并用qRT-PCR检测转染效果,最后采用台盼蓝计数法、Transwell法以及流式细胞仪分别对细胞活力、细胞迁移侵袭和细胞凋亡进行检测,Western blot检测凋亡相关因子的表达水平。<br>  2. lncRNA CCAT2与miR-216b在子宫内膜癌细胞中的调控关系:首先将sh-CCAT2及对照shNC转染到子宫内膜癌细胞HEC-1-A和RL95-2中,并利用实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测细胞中miR-216b的表达水平,采用双荧光素酶报告基因分析miR-216b与lncRNA CCAT2的结合;此外通过向HEC-1-A和RL95-2细胞中转染miR-216b mimic以及miR-216b inhibitor将细胞中miR-216b的表达水平上调或下调,并利用台盼蓝计数法、Transwell法以及流式细胞仪分别检测miR-216b和CCAT2表达下调后的细胞活力、细胞迁移和侵袭率以及细胞凋亡率,最后Western blot检测细胞凋亡相关因子的表达水平。<br>  3. miR-216b在子宫内膜癌中作用机制解析:利用细胞转染术将miR-216b mimic、miR-216b inhibitor 以及阴性对照 mimic NC、inhibitor NC 转染到子宫内膜癌细胞HEC-1-A和RL95-2,利用实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和Western blot检测转染后Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平;为进一步研究Bcl-2与信号通路的关系,将pc-Bcl-2与sh-Bcl-2及阴性对照pcDNA3.1、shNC转染到HEC-1-A和RL95-2细胞中,并且利用qRT-PCR和Western blot检测传染效果;最后利用Western blot检测Bcl-2表达异常对PTEN/PI3K/AKT与mTOR信号通路的影响。<br>  结果:<br>  1. lncRNA CCAT2在子宫内膜癌细胞中的作用:在30对癌症组织中CCAT2的表达水平要显著高于非癌组织( P<0.001 );在转染了sh-CCAT2的子宫内膜癌细胞HEC-1-A和RL95-2中,CCAT2的表达水平和对照相比都明显下调(P<0.01);对细胞活力、细胞迁移、细胞侵袭以及细胞凋亡进行检测发现,与shNC对照组相比,细胞活力(P<0.05或P<0.01)、细胞迁移率(P<0.05)以及细胞侵袭能力(P<0.01)都显著下降,而细胞凋亡率却显著升高(P<0.001),Western blot检测凋亡相关因子的表达水平发现,在CCAT2沉默后,在两种子宫内膜癌细胞中Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)、裂解caspase-3以及裂解caspase-9的表达水平与shNC对照组相比都显著增多。<br>  2. lncRNA CCAT2与miR-216b在子宫内膜癌细胞中的调控关系:在子宫内膜癌细胞HEC-1A及RL95-2中,当CCAT2表达受抑制时,细胞中miR-216b的表达水平都明显上调(P<0.01),双荧光素酶报告基因分析显示,在CCAT2野生型细胞中,荧光素酶的活性显著降低(P<0.05);lncRNA CCAT2表达沉默导致细胞活力降低、细胞迁移和侵袭能力降低、细胞凋亡率升高,而当miR-216b表达受到抑制时,却能够减轻lncRNA CCAT2表达沉默带来的这种影响(P<0.05),同样当miR-216b表达受到抑制时能够降低在lncRNA CCAT2表达沉默导致的细胞凋亡相关因子Bax、裂解caspase-3以及裂解caspase-9的表达上调。<br>  3. miR-216b在子宫内膜癌中作用机制解析:在子宫内膜癌细胞HEC-1A及RL95-2中,转染miR-216b mimic后,细胞中Bcl-2的mRNA表达水平显著下调(P<0.05),相反,当转染miR-216b inhibitor后,细胞中Bcl-2的mRNA表达水平显著上调(P<0.01),Western blot结果也与mRNA表达水平结果一致;将pc-Bcl-2与sh-Bcl-2及阴性对照pcDNA3.1、shNC转染到HEC-1-A和RL95-2细胞中,qRT-PCR和Western blot结果显示在细胞中成功将Bcl-2表达上调或者下调;Western blot检测信号通路活性发现,结果发现,当Bcl-2过表达时,p-S6、p-mTOR、p-PI3K、p-AKT的表达水平增加, PTEN由于下游信号通路的激活表达水平降低,而当Bcl-2沉默时,p-S6、p-mTOR、p-PI3K、p-AKT的表达水平均减少,而PTEN的表达水平会增加。<br>  结论:<br>  通过实验我们发现,在子宫内膜癌组织中CCAT2高表达,而当CCAT2表达沉默后,子宫内膜癌细胞的活力、迁移和侵袭能力都下降,而凋亡水平却显著增高,说明CCAT2的沉默能够抑制子宫内膜癌细胞的生长和转移,也进一步说明CCAT2与子宫内膜癌存在紧密的联系;进一步研究发现,在子宫内膜癌细胞HEC-1-A和RL95-2中, lncRNA CCAT2能通过海绵作用调控miR-216b的表达,并且能通过调控miR-216b的表达抑制肿瘤的生长;在子宫内膜癌细胞中还发现, Bcl-2 的低表达能够降低PTEN/PI3K/AKT与mTOR信号通路活性,miR-216b抑制肿瘤的作用可能是通过下调Bcl-2的表达水平,引起PTEN/PI3K/AKT与mTOR信号通路活性下降,最终导致肿瘤细胞的生长受到抑制,该研究为我们对子宫内膜癌的预防、诊断以及治疗提供了新的方向。

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