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摘要子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，子宫内膜癌多发于绝经期或者绝经后的妇女，在中国子宫内膜癌发病的平均年龄为55岁。近年来，随着我国经济的飞速发展，人们的生活习惯和饮食结构也发生了改变，子宫内膜癌的发病率也逐渐升高，此外、糖尿病、肥胖以及高血压的发生也会使子宫内膜癌的患病机率增加。目前，关于子宫内膜癌的治疗主要是以手术治疗，还有化疗、内分泌治疗以及放疗等加以辅助，尽管研究发现，子宫内膜癌患者早期中5年无病的存活率可高达90%以上，但仍有一些晚期的子宫内膜癌患者会遭受疾病的复发或者死亡，因此，更好地了解子宫内膜癌的发病机制，有助于我们寻找一种更有效的子宫内膜癌治疗策略。<br>　　长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是由200多个核苷酸组成的非编码RNA，主要分布在细胞核、细胞质和细胞器中，起初对这些大量的略长的非编码RNA由于缺少功能的注释并没有引起重视。随后研究发现lncRNA能调节生物的生长发育，并且与肿瘤的生成、发展、迁移以及侵袭有密切联系，在某些肿瘤组织中， LncRNA的表达会出现异常，如：lncRNA H19在宫颈癌、前列腺癌、肝癌以及食管癌中表达量明显增加。lncRNA还能影响肿瘤细胞的凋亡和细胞周期。lncRNA可以与靶基因直接作用来抑制或增强靶基因的表达，从而调控基因的表达，还可以成为一种竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）和miRNA进行调控，共同介导靶基因的表达，并且与肿瘤等的发生与发展有密切联系。<br>　　lncRNA结肠癌相关转录本2（Colon cancer-associated transcript 2，CCAT2）是Ling等发现的一种lncRNA，该基因中含有与癌症相关的rs6983267 SNP，还有一段高度保守的8q24区域，CCAT2本身在正常的结肠癌组织中表达水平并不高，但是在微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）的结肠癌癌症组织中高表达，并且促进肿瘤的生长、迁移和染色体不稳定。除此之外，CCAT2也与宫颈癌、肺癌、食管鳞状细胞癌以及胃癌的发生有关，但是在子宫内膜癌中作用却未见报道。<br>　　在肿瘤的形成和发展中，细胞的凋亡会发生异常，细胞凋亡是细胞在一系列信号的刺激下经过信号传导通路，最终导致细胞发生程序性主动死亡的过程。研究发现，B-细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）在恶性肿瘤的形成过程中发挥重要的作用，它能作用于原癌基因，使细胞进一步发生恶化。在淋巴瘤、胃肠道肿瘤以及膀胱癌中都发现，Bcl-2存在过量表达，并且发现过量表达的Bcl-2阻止细胞发生凋亡，使恶性肿瘤不断发展。第10号染色体缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）/磷酯酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT/PKB）与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路在肿瘤的繁殖、凋亡以及侵袭也发挥重要的作用。<br>　　目的：<br>　　本研究的主要目的是探究lncRNA CCAT2在子宫内膜癌细胞中的作用及其作用机制，首先研究lncRNA CCAT2对子宫内膜癌细胞HEC-1A及RL95-2活力、迁移、侵袭以及凋亡的影响，然后对lncRNA CCAT2与miR-216b在子宫内膜癌细胞中的调控关系进行研究，最后对lncRNA CCAT2与miR-216b在子宫内膜癌中的作用机制进行解析。<br>　　方法：<br>　　1. lncRNA CCAT2在子宫内膜癌细胞中的作用：首先选取30对子宫内膜癌组织和其对应的非癌组织，并利用实时定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）检测CCAT2的表达水平，为进一步研究LncRNA CCAT2的作用，利用shRNA干扰技术降低子宫内膜癌细胞中CCAT2的表达水平并用qRT-PCR检测转染效果，最后采用台盼蓝计数法、Transwell法以及流式细胞仪分别对细胞活力、细胞迁移侵袭和细胞凋亡进行检测，Western blot检测凋亡相关因子的表达水平。<br>　　2. lncRNA CCAT2与miR-216b在子宫内膜癌细胞中的调控关系：首先将sh-CCAT2及对照shNC转染到子宫内膜癌细胞HEC-1-A和RL95-2中，并利用实时定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）检测细胞中miR-216b的表达水平，采用双荧光素酶报告基因分析miR-216b与lncRNA CCAT2的结合；此外通过向HEC-1-A和RL95-2细胞中转染miR-216b mimic以及miR-216b inhibitor将细胞中miR-216b的表达水平上调或下调，并利用台盼蓝计数法、Transwell法以及流式细胞仪分别检测miR-216b和CCAT2表达下调后的细胞活力、细胞迁移和侵袭率以及细胞凋亡率，最后Western blot检测细胞凋亡相关因子的表达水平。<br>　　3. miR-216b在子宫内膜癌中作用机制解析：利用细胞转染术将miR-216b mimic、miR-216b inhibitor 以及阴性对照 mimic NC、inhibitor NC 转染到子宫内膜癌细胞HEC-1-A和RL95-2，利用实时定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）和Western blot检测转染后Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平；为进一步研究Bcl-2与信号通路的关系，将pc-Bcl-2与sh-Bcl-2及阴性对照pcDNA3.1、shNC转染到HEC-1-A和RL95-2细胞中，并且利用qRT-PCR和Western blot检测传染效果；最后利用Western blot检测Bcl-2表达异常对PTEN/PI3K/AKT与mTOR信号通路的影响。<br>　　结果：<br>　　1. lncRNA CCAT2在子宫内膜癌细胞中的作用：在30对癌症组织中CCAT2的表达水平要显著高于非癌组织（ P<0.001 ）；在转染了sh-CCAT2的子宫内膜癌细胞HEC-1-A和RL95-2中，CCAT2的表达水平和对照相比都明显下调（P<0.01）；对细胞活力、细胞迁移、细胞侵袭以及细胞凋亡进行检测发现，与shNC对照组相比，细胞活力（P<0.05或P<0.01）、细胞迁移率（P<0.05）以及细胞侵袭能力（P<0.01）都显著下降，而细胞凋亡率却显著升高（P<0.001），Western blot检测凋亡相关因子的表达水平发现，在CCAT2沉默后，在两种子宫内膜癌细胞中Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 Associated X Protein，Bax）、裂解caspase-3以及裂解caspase-9的表达水平与shNC对照组相比都显著增多。<br>　　2. lncRNA CCAT2与miR-216b在子宫内膜癌细胞中的调控关系：在子宫内膜癌细胞HEC-1A及RL95-2中，当CCAT2表达受抑制时，细胞中miR-216b的表达水平都明显上调（P<0.01），双荧光素酶报告基因分析显示，在CCAT2野生型细胞中，荧光素酶的活性显著降低（P<0.05）；lncRNA CCAT2表达沉默导致细胞活力降低、细胞迁移和侵袭能力降低、细胞凋亡率升高，而当miR-216b表达受到抑制时，却能够减轻lncRNA CCAT2表达沉默带来的这种影响（P<0.05），同样当miR-216b表达受到抑制时能够降低在lncRNA CCAT2表达沉默导致的细胞凋亡相关因子Bax、裂解caspase-3以及裂解caspase-9的表达上调。<br>　　3. miR-216b在子宫内膜癌中作用机制解析：在子宫内膜癌细胞HEC-1A及RL95-2中，转染miR-216b mimic后，细胞中Bcl-2的mRNA表达水平显著下调（P<0.05），相反，当转染miR-216b inhibitor后，细胞中Bcl-2的mRNA表达水平显著上调（P<0.01），Western blot结果也与mRNA表达水平结果一致；将pc-Bcl-2与sh-Bcl-2及阴性对照pcDNA3.1、shNC转染到HEC-1-A和RL95-2细胞中，qRT-PCR和Western blot结果显示在细胞中成功将Bcl-2表达上调或者下调；Western blot检测信号通路活性发现，结果发现，当Bcl-2过表达时，p-S6、p-mTOR、p-PI3K、p-AKT的表达水平增加， PTEN由于下游信号通路的激活表达水平降低，而当Bcl-2沉默时，p-S6、p-mTOR、p-PI3K、p-AKT的表达水平均减少，而PTEN的表达水平会增加。<br>　　结论：<br>　　通过实验我们发现，在子宫内膜癌组织中CCAT2高表达，而当CCAT2表达沉默后，子宫内膜癌细胞的活力、迁移和侵袭能力都下降，而凋亡水平却显著增高，说明CCAT2的沉默能够抑制子宫内膜癌细胞的生长和转移，也进一步说明CCAT2与子宫内膜癌存在紧密的联系；进一步研究发现，在子宫内膜癌细胞HEC-1-A和RL95-2中， lncRNA CCAT2能通过海绵作用调控miR-216b的表达，并且能通过调控miR-216b的表达抑制肿瘤的生长；在子宫内膜癌细胞中还发现， Bcl-2 的低表达能够降低PTEN/PI3K/AKT与mTOR信号通路活性，miR-216b抑制肿瘤的作用可能是通过下调Bcl-2的表达水平，引起PTEN/PI3K/AKT与mTOR信号通路活性下降，最终导致肿瘤细胞的生长受到抑制，该研究为我们对子宫内膜癌的预防、诊断以及治疗提供了新的方向。