检索历史 清除

摘要目的：<br>　　通过建立风寒湿痹证胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型、大鼠模型，培养风寒湿痹证CIA模型大鼠膝关节滑膜组织中成纤维样滑膜细胞（FLS），应用近红外荧光活体成像技术，围绕TLR4/NF-κB信号通路，从“滑膜组织-滑膜细胞-信号通路-靶向基因”角度，多层次地整体探究风湿宁治疗类风湿关节炎（RA）的药效作用机制。<br>　　方法：<br>　　第一部分，不同外感致病因素对病证结合CIA模型建立的比较研究。<br>　　将110只SPF级雌性Wistar大鼠随机分为4组：空白对照组（10只）、CIA模型组（40只）、风寒湿痹证CIA模型组（30只）、风湿热痹证CIA模型组（30只）。采用风寒湿、风湿热外感致病因素刺激，结合牛II型胶原乳化剂诱导的方法，建立CIA模型、风寒湿痹证CIA模型、风湿热痹证CIA模型。分别采用疗效确切的验方风湿宁（18.24g·kg-1）与治痹经方乌头汤（4.9g·kg-1）、白虎加桂枝汤（10.15g·kg-1），对这三种RA模型加以治疗。运用以方测证的反证法和比较医学手段的正证法，观察模型大鼠的足掌温度、关节炎指数、关节肿胀度、血清RF、ACPA含量，踝关节病理学改变等指标，界定这三种RA模型的中医证候属性，从而确定下一步研究风湿宁药效作用机制的最佳动物模型。<br>　　第二部分，近红外荧光探针在风寒湿痹证CIA小鼠模型中成像的应用研究。<br>　　将48只SPF级BALB/c雌性小鼠随机分为4组：空白对照组、模型对照组、阳性对照组（3mg·kg-1）、风湿宁治疗组（23.45g·kg-1），每组12只。采用风寒湿外感致病因素刺激，结合牛II型胶原乳化剂诱导的方法，建立风寒湿痹证CIA小鼠模型。造模成功后，各组小鼠给予相应药物灌胃干预，每日1次，连续28天。末次灌胃1h后，通过尾静脉注射近红外荧光分子探针IRDye? 800CW 2-DG，在活体水平上对小鼠RA炎症进行实时、动态、荧光成像观察，并对风湿宁治疗风寒湿痹证CIA小鼠模型的药效作用进行初步宏观探讨。<br>　　第三部分，风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型滑膜组织中TLR4/NF-κB信号通路的作用机制研究。<br>　　将54只SPF级雌性Wistar大鼠随机分为6组：空白对照组、模型对照组、阳性对照组（2.33mg·kg-1）、风湿宁低、中、高剂量组（9.12，18.24，36.48 g·kg-1），每组9只。采用风寒湿外感致病因素刺激，结合牛II型胶原乳化剂诱导的方法，建立风寒湿痹证CIA大鼠模型。造模成功后，各组大鼠给予相应药物灌胃干预，每日1次，连续28天。运用ELISA、HE、TUNEL、IHC、Real-time PCR、Western Blot等方法对大鼠血清RF、ACPA，炎性细胞因子IL-1β、TNF-α，抗炎细胞因子IL-4、IL-10，膝、踝关节病理学改变，滑膜组织细胞凋亡，滑膜组织中c-IAP1、XIAP、Caspase-3、Caspase-9表达，TLR4、MyD88、IκB-α、NF-κB mRNA和蛋白表达等进行检测，从TLR4/NF-κB信号通路上深入探讨风湿宁治疗RA的药效作用机制。<br>　　第四部分，风湿宁含药血清对风寒湿痹证CIA-FLS增殖、凋亡和TLR4/NF-κB信号通路的作用机制研究。<br>　　采用组织块培养法，对风寒湿痹证CIA模型大鼠膝关节滑膜组织中FLS进行原代培养、传代和鉴定。将第3代CIA-FLS细胞随机分为6组：空白血清对照组、来氟米特含药血清组、5，10，15，20%风湿宁含药血清组。运用CCK-8、TUNEL、ELISA、Real-time PCR、Western Blot等方法对CIA-FLS细胞增殖、凋亡，细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10含量，CIA-FLS细胞中TLR4、MyD88、IκB-α、NF-κB mRNA和蛋白表达等进行检测，围绕TLR4/NF-κB信号通路，在细胞层面上，对风湿宁含药血清的药效作用机制进一步深入探讨。<br>　　结果：<br>　　第一部分，与空白对照组相比，CIA模型各组大鼠整体状况，随着时间推移持续性加重，体质量增长缓慢，关节炎指数和关节肿胀度明显升高，血清RF、ACPA含量显著上升，其中以风湿热痹证CIA模型对照组最为严重。风湿宁与治痹经方各治疗组大鼠灌服相应中药水煎液后，除风湿热痹证CIA风湿宁治疗组外，精神状态均逐渐好转，足掌温度、血清RF、ACPA含量有所下降，关节肿胀程度有所减轻，行动迟缓情况逐步改善，皮毛光泽度、爪甲形态、舌象等异常状况逐渐恢复。踝关节HE染色结果显示，CIA模型各组大鼠滑膜组织均有不同程度的增生和血管翳的形成，关节软骨可见不同程度的退行性变及骨质的破坏。各治疗组大鼠灌服相应药物后，对滑膜组织增生、炎性细胞浸润、血管翳形成、骨质侵蚀等均有不同程度的抑制作用。其中，治疗各组组间比较，以CIA白虎加桂枝汤治疗组、风寒湿痹证CIA风湿宁治疗组、风湿热痹证CIA白虎加桂枝汤治疗组改善效果尤为显著。<br>　　第二部分，与空白对照组相比，模型对照组小鼠精神不振，倦怠少动，弓背蜷缩，喜扎堆，皮毛暗淡无泽，踝关节和足趾关节肿胀、变形，爪甲细长，色淡白，肛周污秽，小便清长，体质量增长减慢甚至减轻。风湿宁治疗组小鼠灌服中药水煎液后，与模型对照组比较，精神状态逐渐好转，体质量逐渐增长，足掌温度有所恢复，关节炎指数与踝关节宽度下降，关节肿胀程度有所减轻。近红外荧光活体成像结果显示，尾静脉注射2-DG荧光探针24h后，小鼠体内可观察到荧光信号；注射48h后，2-DG探针对关节炎特异性靶向效果佳，达到浓聚高峰，与正常组织对比明显；注射72h后，空白对照组小鼠体内2-DG探针逐渐排出体外，荧光信号减弱；模型对照组小鼠持续成像96h，仍可在炎症部位观察到荧光信号；风湿宁治疗组小鼠对2-DG探针在不同时刻的摄取量，较模型对照组少。<br>　　第三部分，与空白对照组比较，模型对照组大鼠关节炎指数、关节肿胀度、血清RF、ACPA、IL-1β、TNF-α水平，脾脏、胸腺指数，膝踝关节组织病理学评分极显著升高（P＜0.01），血清IL-4、IL-10水平，滑膜组织细胞凋亡率极显著下降（P＜0.01），滑膜组织中c-IAP1、XIAP表达极显著上升（P＜0.01），Caspase-3、Caspase-9表达极显著下降（P＜0.01），TLR4/NF-κB信号通路表达极显著上调（P＜0.01）。与模型对照组比较，风湿宁各剂量组大鼠灌胃治疗28天后，关节炎指数、关节肿胀度、血清RF、ACPA、IL-1β、TNF-α水平显著或极显著下降（P＜0.05，P＜0.01），脾脏、胸腺指数，膝踝关节组织病理学评分显著或极显著下降（P＜0.05，P＜0.01），血清IL-4、IL-10水平，滑膜组织细胞凋亡率显著或极显著上升（P＜0.05，P＜0.01），滑膜组织中c-IAP1、XIAP表达显著或极显著下降（P＜0.05，P＜0.01），Caspase-3、Caspase-9表达显著或极显著上升（P＜0.05，P＜0.01），TLR4、MyD88、IκB-α、NF-κB mRNA与蛋白表达均显著或极显著下调（P＜0.05，P＜0.01），其中，风湿宁高剂量组TLR4/NF-κB信号通路表达下调程度尤为显著。<br>　　第四部分，CIA-FLS细胞传至3-6代，形态均一，呈长梭形。细胞免疫荧光鉴定，胞浆中Vimentin蛋白表达呈阳性。CCK-8、TUNEL法检测结果显示，风湿宁含药血清各浓度组处理CIA-FLS细胞24h、48h、72h后，对其增殖体现出抑制作用，且呈时间与浓度依赖性。与空白血清对照组同时段比较，其抑制作用有极显著性差异（P＜0.01）；10，15，20%风湿宁含药血清处理细胞24h后，显著或极显著促进了CIA-FLS细胞的凋亡（P＜0.05，P＜0.01）。ELISA法检测结果显示，风湿宁含药血清各浓度组处理CIA-FLS细胞24h后，较空白血清对照组，可降低细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α水平，提高IL-4、IL-10水平，有显著或极显著统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。Real-time PCR、Western Blot法检测结果显示，风湿宁含药血清各浓度组处理CIA-FLS细胞24h后，细胞中TLR4、MyD88、IκB-α、NF-κB mRNA与蛋白表达均显著或极显著下调（P＜0.05，P＜0.01），其中，20%风湿宁含药血清组下调程度尤为显著。<br>　　结论：<br>　　①以CIA模型为基础，结合风、寒、湿、热等不同外感致病因素刺激，成功建立风寒湿痹证CIA大鼠模型和风湿热痹证CIA大鼠模型。<br>　　②运用近红外荧光分子探针IRDye? 800CW 2-DG，在活体水平上对风寒湿痹证CIA小鼠模型成功炎症靶向性荧光显像，风湿宁对模型小鼠足掌和关节的局部炎症有明显改善作用。<br>　　③风湿宁对风寒湿痹证CIA模型大鼠具有明显的治疗作用，其药效作用机制可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，抑制IL-1β、TNF-α产生，下调c-IAP1、XIAP表达，降低脾脏、胸腺指数，促进IL-4、IL-10生成，促进滑膜组织细胞凋亡，提高Caspase-3、Caspase-9表达，从而产生了抗炎和免疫调节作用，达到治疗RA的效果，且其疗效与药物剂量有一定相关性。<br>　　④风湿宁含药血清能抑制CIA-FLS细胞增殖，促进其凋亡，且呈时间与浓度依赖性。其作用机制可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的异常活化，抑制IL-1β、TNF-α产生，促进IL-4、IL-10生成，从而抑制RA滑膜增生，减轻滑膜炎症。