检索历史 清除

摘要目的：<br>　　本研究采用网络药理学和“气滞寒凝血瘀证”模型，从计算机虚拟预测和动物实验验证两个方面对沙棘总黄酮抗血管内皮损伤作用及其作用机制进行研究。通过网络药理学的手段分析槲皮素、异鼠李素、山柰素等成分抗血管内皮损伤的潜在作用靶点和信号通路，同时建立“气滞寒凝血瘀证”大鼠模型，检测沙棘总黄酮对该模型大鼠的内皮分泌功能、血流流变学、内皮细胞损伤的分子标志物和血管内皮组织病理学等指标的影响。进一步对网络药理学已预测的靶点进行验证，探索沙棘总黄酮保护“气滞寒凝血瘀证”模型大鼠血管内皮细胞的作用机制。<br>　　实验方法：<br>　　1.网络药理学分析<br>　　（1）通过文献考察和TCMSP数据库查询共获得了沙棘所含化学成分的分子结构。再对上述化合物进行口服生物利用度以及成药性分析，并进行结构辨别，筛选出符合筛选条件的黄酮类化合物。采用ChemMapper服务器对上述化合物进行潜在靶点的预测分析。<br>　　（2）本研究通过OMIM数据库搜索得到与“血管内皮损伤”相关的蛋白或者基因信息，以及通过MAS 3.0得到与疾病靶点由直接相互作用的蛋白质，最后用Cystoscope软件构建与内皮损伤相关的疾病网络。并将预测得到的作用靶点与疾病网络中相关靶点比对。<br>　　（3）将预测获取的靶点蛋白信息导入MAS 3.0数据库,即可得到靶点的相关通路信息。利用此数据库可以得到的通路进行通路注释及GO富集分析，以及结合KEGG数据库进行通路分析。<br>　　（4）通过Cystoscope软件建立“化合物?靶点?通路”网络模式，绘制沙棘黄酮类化合物分子与靶蛋白作用网络图。并运用network analyzer插件分析藏药沙棘黄酮类成分治疗血管内皮损伤的“化合物-靶点-通路”网络图。<br>　　2. 沙棘总黄酮对“气滞寒凝血瘀证”模型大鼠的影响<br>　　（1）本实验采用肾上腺素合冰水浴建立“气滞寒凝血瘀证”大鼠模型，评估沙棘总黄酮对该模型大鼠相关指标的影响。将实验动物随机分为7组：空白对照组、模型对照组、阿司匹林组、复方丹参片组、TFE高剂量组、TFE中剂量组和TFE低剂量组。连续灌胃给药15天，每日1次。实验的第10天至第14天，除空白对照组之外的所有大鼠皮下注射的盐酸肾上腺素，每日三次。从实验的第13到14天，每次注射盐酸肾上腺素后，将所有大鼠进行冰水浴处理，以此方法复制“气滞寒凝血瘀证”内皮损伤大鼠模型。末次给药后，由腹主动脉取血，以3.8%枸橼酸钠溶液(1∶9) 抗凝，吸取部分血液检测测量WBV，剩余血浆用以测定PT，APTT和FIB含量。<br>　　（2）采用ELISA法检测血浆中TXB2，6-keto-PGF1α，vWF和TM的含量。同时对胸主动脉进行组织病理学检查。另外采用qRT-PCR方法，测定胸主动脉中PI3K，MAPK1，Bcl-2和Caspase-3基因表达水平，验证网络药理学预测结果和分析探讨沙棘总黄酮保护血管内皮细胞的潜在作用机制。<br>　　实验结果：<br>　　1. 沙棘总黄酮治疗内皮损伤的网络药理学分析<br>　　采用ChemMapper、KEGG、MAS 3.0等数据库和Cytoscape软件，沙棘中槲皮素、异鼠李素、山柰素、花葵素、表儿茶素、儿茶素和AC1LDVZ 7个黄酮类成分对进行靶点预测，构建了沙棘“化合物-靶点-通路”网络图。直观地呈现了7个化合物、35个靶蛋白、44条作用通路与血管内皮损伤之间的关系。分析可以看出，MAPK1、PIK3R1、PIK3R2、PIK3CG等为网络中节点度最高的节点，提示它们可能是沙棘总黄酮治疗血管内皮损伤的核心作用靶点。其中VEGF信号通路为显著性最大的通路，提示VEGF信号通路可能是沙棘总黄酮治疗内皮损伤的核心作用途径。<br>　　2. 沙棘总黄酮对“气滞寒凝血瘀证”模型大鼠血液流变学的影响<br>　　结果表明，与空白对照组比较，模型对照组在1 s-1，5 s-1，50 s-1，100 s-1和200 s-1剪切速率下WBV增加有统计学意义（P<0.01）。经沙棘总黄酮干预后，可以使WBV减低。与模型对照组相比，沙棘总黄酮治疗组（高、中剂量）的所有切变率下的WBV显著降低（P<0.05或P<0.01）。与模型对照组比较，阳性对照组，阿司匹林组和FFDSP组明显降低（P<0.05或P<0.01）。沙棘总黄酮浓度组显著抑制由肾上腺素加冰水浴引起的WBV增加，但在实验浓度范围内效果不显著。TFE-L，TFE-M和TFE-H各组之间的WBV无显著性差异。<br>　　3. 沙棘总黄酮对“气滞寒凝血瘀证”模型大鼠凝血功能（PT、APTT和FIB）和血管内皮细胞分泌功能的影响<br>　　结果显示，与空白对照组对比，模型对照组大鼠的PT和APTT缩短，FIB水平下降（P<0.01）。经过沙棘总黄酮干预后，沙棘总黄酮（0.24，0.48 g/kg剂量）显著能延长PT，APTT（P<0.05或P<0.01）以及降低FIB含量（P<0.01）。随着浓度的增加，沙棘总黄酮对抗模型大鼠PT，APTT缩短和FIB含量增加的作用逐渐增强，TFE-L组与TFE-H组比较差异有统计学意义（P<0.01）；对大鼠血浆TXB2和6-keto-PGF1α的含量测定结果表明，与空白对照组相比，模型对照组TXB2、6-keto-PGF1α含量有显著差异（P<0.01）。其中高剂量的沙棘总黄酮治疗可以有效地对抗TXB2水平的升高（P<0.05）；中、高剂量的沙棘总黄酮治疗可显著降低6-keto-PGF1α的水平（P<0.01）。<br>　　4. 沙棘总黄酮对“气滞寒凝血瘀证”模型大鼠胸主动脉内皮损伤的影响<br>　　胸主动脉组织病理学检查结果显示，与模型对照组相比，空白对照组胸主动脉内膜光滑，中膜平滑肌细胞整齐排列，无平滑肌细胞增生。模型对照组胸主动脉内皮层脱落甚至断裂，弹力纤维增生，平滑肌细胞排列不规则。阳性对照组和沙棘总黄酮治疗组的内皮细胞脱落程度较轻，内皮层较清晰完整。对内皮细胞损伤的分子标志物vWF和TM测定结果表明，模型对照组血浆vWF和TM水平均显著高于空白对照组（P<0.01）；与模型对照组比较，沙棘总黄酮能显著下调血浆vWF水平和TM水平（P<0.01）。而通过qRT-PCR分析，证实了受沙棘总黄酮干预治疗的四个基因表达变化趋势。与空白对照组相比，模型对照组PI3K和MAPK1表达有上调趋势，但无显著性差异（P>0.05）； Bcl-2表达显著降低（P<0.05）；Caspase-3表达显著增加（P<0.01）。此外，各实验组MAPK1表达无显著性差异（P>0.05）。与模型对照组比较，沙棘总黄酮干预治疗后PI3K和Bcl-2的表达显著增加（P<0.05或P<0.01），Caspase-3的表达显著下降（P<0.05或P<0.01）。<br>　　结论：<br>　　1. 网络药理学结果表明，MAPK1、PIK3R1、PIK3R2、PIK3CG可能是沙棘总黄酮治疗血管内皮损伤的核心作用靶点，VEGF信号通路可能是沙棘总黄酮治疗内皮损伤的核心作用途径。<br>　　2. 沙棘总黄酮可显著改善“气滞寒凝血瘀证”模型大鼠的血液流变学、凝血功能和血管内皮细胞分泌功能，具有活血化淤的作用。<br>　　3. 沙棘总黄酮可显著下调该模型大鼠血浆中TXB2水平，上调血浆中6-keto-PGF1α水平，使两者比例（T/K）下降，表明沙棘总黄酮的抗血瘀作用与参与对TXA2和PGI2的调节有关。<br>　　4. 沙棘总黄酮能够明显减轻盐酸肾上腺素结合冰水浴处理所造成的血管内皮细胞损伤，降低血浆中vWF和TM含量。沙棘总黄酮可能通过激活PI3K/Bcl-2/Caspase-3途径，抑制血管内皮细胞凋亡，使造模方法所致病理状态下的血管内皮细胞损伤程度降低，从而保护和维持血管内皮的完整性。