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摘要目的：<br>　　PD-1/PD-L1是目前抗癌药物研发的明星靶点，截止到2018年3月，全球已经有5个抗PD-1/PD-L1的抗体药物上市，并取得了良好的临床疗效。靶向该通路的抗体药物通过阻断PD-1/PD-L1的结合，消除PD-1蛋白对抗原呈递信号的负向调控作用，恢复T细胞对PD-L1过表达的肿瘤细胞的识别杀伤能力，达到克服肿瘤免疫逃逸的目的。正常情况下PD-1胞外域接受配体提供的信号，负向调控T细胞的活化与增殖，避免T细胞过度活化导致的自身免疫性疾病。但该通路被PD-L1过表达的肿瘤细胞利用后，会促进肿瘤细胞的免疫逃逸。针对该通路的特点，本课题靶向PD-1与PD-L1结合的配体界面区设计了一种高亲和力的纳米抗体，通过阻断PD-1胞外域与PD-L1的结合，恢复T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。<br>　　方法：<br>　　1.噬菌体展示技术淘筛高亲和力抗体<br>　　通过生物信息学的手段，模拟PD-1与PD-L1的结合，确定胞外域与配体结合界面的氨基酸序列，并人工合成该段序列。从商用人单域抗体噬菌体展示库中经多轮ELISA淘筛获取对结合界面的高亲和力单域抗体。通过测序获得DNA序列后，翻译获得其氨基酸序列。<br>　　2.单域抗体的真核表达系统构建<br>　　（1）单域抗体氨基酸序列的优化：通过与同源人单域抗体比较，对可能发生突变的氨基酸进行修正。<br>　　（2）真核表达目的基因的合成与载体构建<br>　　取优化后的抗体序列，用毕赤酵母偏爱密码子优化，在该基因的前端加上MF-α分泌信号肽、在末端加上His tag与终止子、在两端加入酶切位点XhoⅠ与XbaⅠ，并人工合成该基因。通过PCR法扩增。与pGAPzα-A空载体双酶切后，用T4连接酶连接，并转化至E.coli JM109中。<br>　　（3）毕赤酵母X-33高效表达株的构建与筛选<br>　　提取重组质粒，线性化并电转化至表达宿主毕赤酵母X-33。通过菌落PCR与博来霉素（Zeocin）高抗性筛选获得阳性转化子，并通过表达鉴定获得高表达菌株。<br>　　（4）真核表达系统表达产物的纯化与亲和力常数测定<br>　　取发酵上清液，用过硫酸铵沉淀除去大部分杂质后，通过分子筛与镍柱进行纯化。纯化产物置换缓冲液后，用ELISA法检测，确定亲和力常数。<br>　　（5）糖基化鉴定：取纯化后的产物用内切糖苷酶H（Endo H）鉴定糖基化。<br>　　3.单域抗体的原核表达系统构建<br>　　（1）原核表达目的基因的合成与载体构建<br>　　取优化后的序列，在末端加入His与终止子、在两端加入pET21b载体上含有的Nde Ⅰ、Hind Ⅲ两个酶切位点人工合成后PCR扩增，并通过双酶切试验连接至pET21b上，热激法转化至E.coli DH5α。<br>　　（2）E.coli BL21(DE）的高效表达株的构建筛选：提取重组质粒，同法转化至E.coli BL21(DE）中，用菌落PCR及表达鉴定的手法进行高表达筛选。<br>　　（3）可溶性表达产物的纯化<br>　　采用低温培养的形式诱导工程菌进行可溶性表达，同法确认表达形式，并用CM柱及镍柱对破菌上清进行纯化。<br>　　3.活性鉴定<br>　　取获得的纯化产物，与人PD-1蛋白共孵育，加至PD-L1蛋白过表达的肿瘤细胞中，用带FITC标记的His tag抗体做二抗，用流式细胞仪检测荧光。<br>　　结果：<br>　　1.噬菌体筛选结果<br>　　成功获17株阳性菌株，通过测序分析16个阳性菌编码序列高度同源，16个阳性菌的编码的V区蛋白序列完全一致。成功淘筛到高亲和力的靶向PD-1配体结合界面的单域抗体。<br>　　2.真核表达体系的构建结果<br>　　将优化后的抗体命名为Nb∶PD-1，成功获得Nb∶PD-1的自分泌型毕赤酵母X-33高效表达株，该工程菌糖基化酶活力不足。并用CM柱与镍柱成功获得纯度较高的表达产物，通过内切糖苷酶确认发生里部分糖基化修饰。<br>　　3.原核表达体系的构建结果<br>　　成功获得Nb∶PD-1的E.coli BL21（DE）高效表达株。成功构建了可溶性表达发酵体系，并成功获得纯度较高的表达产物。<br>　　4.活性鉴定结果<br>　　间接ELISA法测得真核表达的Nb∶PD-1亲和力为106mol/L，原核表达的Nb∶PD-1亲和力为105mol/L。获得的抗体经流式细胞仪鉴定有活性。<br>　　结论：<br>　　成功淘筛到靶向PD-1配体结合界面的单域抗体，并优化了该抗体的氨基酸序列。并成功构建了真核与原核两种表达体系，且成功获得了纯化较高的表达产物，初步鉴定了其具有活性与亲和力。本研究成功研制出靶向PD-1配体结合界面的单域抗体Nb∶PD-1。