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摘要初始纤毛存在于大部分脊椎动物细胞中，是非运动的微管状的细胞表面凸起结构。纤毛不仅作为关键的机械感受细胞器，同时也是几个信号通路的转导位点，包括Hedgehog（Hh）通路。纤毛结构和功能的缺陷会导致广泛的结构性出生异常疾病，而很多缺陷是由于Hh信号的传导被干扰造成的。Hh家族分泌的蛋白在细胞命运、细胞分裂、细胞分化过程中也起着非常重要的作用。Hh信号的缺失会产生一系列出生缺陷疾病，而通路的异常活性则会引发多种类型的癌症。因此，研究清楚纤毛的发育机制和与Hh信号通路之间的关系是亟待解决的问题，这对相关疾病的研究和治疗是至关重要的。<br>　　因此，基于相关报道和实验室之前的研究，在本文的研究中，我们选择了3个纤毛相关蛋白作为主要研究对象，它们分别为：之前的研究发现中心体蛋白Talpid3（Ta3）突变可以降低纤毛的发育和Hh信号通路活性，但是其作用机制并不清楚。另外，Hh对其转录因子Gli蛋白的激活发生在纤毛内，目前也没有相关的证据证明此假设；过渡区蛋白Tectonic3（Tctn3），Tctn1和Tctn2的同源蛋白，只存在于人类基因中，三者都会影响纤毛的发育和Hh信号，但是它们之间的关系并不清楚；基底附属蛋白Dzip1l，是斑马鱼Iguana（Igu）的哺乳动物同源物，据报道可以影响纤毛的功能和Hh信号，但是不影响纤毛的发育，因此我们想知道Dzip1l在纤毛发育中的作用。在这些问题的基础上，本文的主要研究内容包括：<br>　　1.首先构建了Ta3突变的小鼠，获得突变胚胎和细胞。通过胚胎切片免疫荧光染色观察Ta3对纤毛发育和依赖Hh的神经管的发育情况。然后用Western Blot检测胚胎和细胞中Gli2、Gli3和pGli的水平来判断Ta3或药物对Hh信号通路活性的影响。最后构建了不同长度的Ta3突变，通过免疫共沉淀和细胞染色等解析Ta3和Protein kinase A（PKA）之间的相互作用关系，及Ta3在中心粒上的定位情况。通过一系列实验和分析我们直接证明了Gli2和Gli3的去磷酸化和激活是在纤毛内进行的；Ta3突变中Gli2和Gli3过程的降低是由于Gli2和Gli3的磷酸化水平降低造成的；Ta3的N端是其定位到中心体必需的，而C末端则是和PKAR结合必需的；第一次发现PKAR在很多Ta3突变细胞中是错位的，这也可能是Ta3突变中Gli磷酸化水平降低的原因之一。<br>　　2.首先构建了Tctn3突变小鼠，来观察Tctn3基因突变对胚胎发育的影响。然后通过对胚胎切片和突变细胞进行染色，观察Tctn3突变对纤毛发育和Hh信号的影响。随后构建了Tctn1和Tctn2敲入小鼠，来取代Tctn3的位置，获得相应的胚胎，通过免疫染色来观察纤毛的生长发育和神经管的模式发育情况及对应细胞Gli蛋白的表达情况。同时在Tctn3突变细胞中，过表达外源的Tctn1和Tctn2蛋白检测它们是否能够挽救纤毛的发育。另外，利用免疫共沉淀和细胞染色来观察它们3个蛋白之间，及与其它已知过渡区蛋白之间的相互作用关系。截止目前，我们的研究发现小鼠中Tctn3的缺失会导致纤毛发育和Hh信号通路活性的降低；Tctn3缺失的小鼠展现出的表型与Tctn1和Tctn2突变的表型很相似；在缺失Tctn3基因的MEFs中过表达Tctn3蛋白（不是Tctn1和Tctn2蛋白）可以挽救纤毛的发育；类似的，在小鼠中用Tctn1或Tctn2替换Tctn3基因导致纤毛的发育减少，同时有心率失常、随机的心脏循环等表型出现，但是通常应该降低的神经管的模式发育和Gli3Rep过程都没有变化；第一次发现一个纤毛基因可以将纤毛的发育和Hh信号通路分开调控的模型。<br>　　3.通过基因敲除技术获得了Dzip1l突变小鼠，观察突变胚胎的表型。然后通过胚胎切片免疫荧光染色观察到了神经管的模式发育情况，这样可以反映出Dzip1l对Hh信号通路的影响，同时利用透射电子显微镜观察了突变后神经管纤毛的形态特征。接着通过细胞免疫荧光染色，进一步确定了Dzip1l在纤毛中的定位。通过质谱分析，获得了几个和Dzip1l相关的蛋白。然后通过免疫共沉淀和染色反应进一步确定了Dzip1l和这些蛋白之间的相互关系。在此基础上，我们通过小鼠交叉反应得到了Dzip1l-/+;Bromi-/+和Dzip1l-/+;Cby-/+单突变和双突变小鼠胚胎。观察小鼠胚胎表型、胚胎切片中神经管的模式发育情况、神经管和间充质细胞内纤毛的形态数量特征、扫描电镜下纤毛发育各个阶段的特征等来观察分析Dzip1l与Bromi和Cby在纤毛发育及Hh信号中的关系。通过这些实验我们发现Dzip1l的丢失会导致纤毛发育和Hh信号活性明显的下降；Dzip1l和Cby（Chibby，一个基底附属蛋白）相互联系并作用于Cby的上游；Dzip1l可以控制膜蛋白Rpgrip1l到纤毛过渡区的定整合以及中心体蛋白Cp110（capping protein）从母中心粒的移除。最终得到Dzip1l作用于纤毛发育的早期阶段即通过控制Cp110从母中心粒的移除和Rpgrip1l的整合来激发纤毛芽的形成，从而影响纤毛的发育。<br>　　综上所述，本文通过小鼠水平、胚胎水平、细胞水平、分子水平对3个纤毛相关蛋白Ta3、Tctn3和Dzip1l的研究，发现了它们在纤毛发育中的作用及对Hh信号的影响。希望通过本文的研究能够为后续纤毛机制的研究提供参考意见，为相关疾病研究和药物靶点的筛选提供理论依据。