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摘要背景：<br>　　乳腺癌是全球女性常见的恶性肿瘤之一,其发病率居全球女性肿瘤的首位,在亚洲人群中以每年2%的速度增加.目前国际常用的乳腺癌分期为TNM分级法,乳腺癌的分类常采用：Luminal A、Luminal B、ERBB2+型、Basal-like型;其中三阴性乳腺癌(TNBC),被定义为ER(-)、PR(-)、Her2(-),TNBC较其他类型的乳腺癌侵袭性更强,预后更差,缺乏治疗靶点,使之成为难以治疗的乳腺癌类型之一.因此新的乳腺癌治疗靶点与临床药物的研究成为近年来研究的热点.<br>　　白藜芦醇(Resveratrol,RES)是一种有良好生物学活性的多酚类化合物,具有抗氧化、抗、抗炎、抗肿瘤等广谱药理生物学活性.PIM激酶属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族,由PIM-1,PIM-2,PIM-3三个原癌基因共同编码组成,在肿瘤的发生发展、细胞周期、细胞凋亡、细胞代谢、细胞自噬等多个方面发挥作用.有研究发现,在乳腺癌中PIM-1蛋白的表达量明显高于正常乳腺组织.<br>　　目前白藜芦醇的抗肿瘤作用在多种肿瘤包括肝癌、胃癌等体外细胞实验及动物模型上得到证实,但抗肿瘤的作用的机制尚不明确,本实验以乳腺癌细胞株为研究对象,研究白藜芦醇对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及机制,并探讨其抗肿瘤作用与PIM-1激酶的关系,进而为其在乳腺癌的治疗方面提供理论依据.<br>　　第一部分 白藜芦醇对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响<br>　　目的：<br>　　研究白藜芦醇对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响.<br>　　方法：<br>　　将MCF-10A,MDA-MB-231,MDA-MB-436,HCC38,MCF7,T47D乳腺癌细胞株于37℃、5%CO2条件下培养.1、待细胞进入对数生长期,接种96孔板,设置实验组、对照组,加入不同浓度白藜芦醇(DMSO,5,10,20,40μM)作用不同时间(0h,24h,48h,72h)后应用MTT法检测白藜芦醇对乳腺癌细胞增殖的影响;2、应用Soft Agar试验进一步验证白藜芦醇对乳腺癌细胞增殖的影响;3、将细胞接种于6孔板,设置空白对照及不同浓度给药组,应用流式细胞仪检测细胞亡.<br>　　结果：<br>　　1.MTT实验和Soft Agar实验结果显示,白藜芦醇能明显抑制乳腺癌细胞增殖,随着药物浓度(0-40μM)递增及作用时间延长,其抑制率明显增加,相同浓度白藜芦醇作用72h后,其抑制作用均高于24h组,差异具有统计学意义(P<0.05),相同时间白藜芦醇40μM浓度组抑制作用比阴性对照组高,差异具有统计学意义(P<0.05).<br>　　2.流式细胞术分析结果提示：(1)细胞凋亡实验结果显示,随着白藜芦醇浓度增大(0,10,20,40μM),凋亡率从5%增到40%,差异具有统计学意义(P<0.05).(2)细胞周期结果显示,白藜芦醇(10,20,40μM)作用48h后,40μM组G2/M期的比例较阴性对照组均增加20%,提示阻滞G2/M期.<br>　　结论：<br>　　1.一定浓度的白藜芦醇作用于乳腺癌细胞具有增殖抑制和促进凋亡的作用.<br>　　2.白藜芦醇通过阻滞乳腺癌细胞的G2/M期,进而诱导细胞凋亡.<br>　　第二部分 白藜芦醇抗肿瘤活性与PIM-1关系的研究<br>　　目的：<br>　　探讨白藜芦醇对乳腺癌细胞的抗肿瘤活性与PIM-1的关系.<br>　　方法：<br>　　1.乳腺癌细胞株37℃、5%CO2条件下培养.待细胞进入对数生长期,收集MCF-10A,CAM,MDA-MB-231,MDA-MB-436,HCC38,MCF7,T47D,SKBR-3,HCC1954细胞,提取蛋白,通过Western blot检测PIM-1在不同细胞系中的表达情况.<br>　　2.采用蛋白结合实验(binding assay),首先收集乳腺癌细胞T47D的蛋白100ug融合GST标签,对照组将其与能特异性结合的Sephrose4B beads孵育过夜,然后充分洗涤未结合的蛋白,实验组在能特异性结合Res-Sephrose4B beads中添加白藜芦醇孵育过夜,然后充分洗涤未结合的蛋白.最后采用Western blot检测,观察两组PIM-1蛋白的表达情况.<br>　　3.Kinase assay实验,将PIM-1的下游产物BAD(一种促凋亡蛋白)作为底物,设置DMSO为阴性对照组,PIM-1抑制剂(200nM)为阳性对照组,白藜芦醇浓度梯度为0,1,5,10μM,每一组中均加入终浓度0.5mM的ATP,以及PIM-1激酶1ng,BAD蛋白100ng,室温孵育10min,37℃金属浴30min,随后利用Western blot检测p-BAD,BAD及PIM-1的表达情况.<br>　　结果：<br>　　1.Western blot的结果显示PIM-1蛋白条带的灰度值较正常乳腺细胞高,提示乳腺癌细胞中存在PIM-1蛋白的过表达.<br>　　2.Binding assay的结果显示Res-Sephrose4B组相对Sephrose4B组PIM-1蛋白有较强的表达.提示白藜芦醇可以与PIM-1蛋白相结合.<br>　　3.Kinase assay的结果显示随着白藜芦醇浓度的增加,BAD的磷酸化抑制越明显,10μM组的抑制效果相对阴性对照组达到70%,与PIM-1Inhibitor阳性对照组的80%十分接近.<br>　　结果表明白藜芦醇可以有效的抑制PIM-1磷酸化BAD的过程,促进乳腺癌细胞的凋亡.<br>　　结论：<br>　　1.PIM-1在乳腺癌细胞中存在过表达;<br>　　2.白藜芦醇可以和PIM-1蛋白相结合;<br>　　3.白藜芦醇通过抑制PIM-1磷酸化BAD的途径,促进乳腺癌细胞的凋亡.