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摘要背景：<br>　　当归多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗辐射、抗氧化等多种生物学活性.Hepcidin是维持机体铁稳态关键的负性调节因子.研究显示：①增加的血清Hepcidin与乳腺癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌和前列腺癌等的发生发展相关.②炎症途径、BMP/SMAD途径和红细胞生成途径可调节肝细胞中Hepcidin的表达.③乳腺癌MCF-7细胞等肿瘤细胞可合成转铁蛋白(transferrin,Tf).④与相应的正常细胞相比,癌细胞高表达转铁蛋白受体1(transferrin receptor1,TfR1)TfR1和转铁蛋白受体2(transferrin receptor1,TfR2)TfR2.本课题组前期研究表明,ASP可抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,并调节铁代谢.<br>　　目的：<br>　　通过免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色、Western blot、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等方法探讨ASP对荷瘤小鼠肿瘤生长影响的可能机制.<br>　　方法：<br>　　1.以人肝癌HepG2细胞和人正常肝L-O2细胞为研究对象,用不同浓度的APS处理细胞,利用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、Western blot方法分析ASP对HepG2和L-O2细胞中Hepcidin基因表达的影响.<br>　　2.以小鼠乳腺癌4T1细胞和小鼠肝癌H22细胞荷瘤小鼠的肝组织和血清为研究对象,通过Western blot、ELISA方法检测ASP对体内Hepcidin表达的影响.<br>　　3.通过ELISA方法检测4T1和H22荷瘤小鼠血清中的铁蛋白、Tf、TfR1、TfR2的水平.<br>　　4.通过Western blot、ELISA方法检测4T1和H22荷瘤小鼠肝组织中IL-6的表达、血清中IL-6的水平.<br>　　5.通过Western blot方法分析4T1和H22荷瘤荷瘤小鼠肝组织中JAK2、磷酸化STAT3、磷酸化Smad1/5/8的表达.<br>　　结果：<br>　　1.ASP对Hepcidin在体外和体内表达的影响<br>　　(1)ASP对HepG2和L-O2细胞中Hepcidin基因表达的影响<br>　　分别用0g/L、0.10g/L、0.20g/L、0.40g/L的ASP处理细胞48h后,RT-PCR方法分析Hepcidin mRNA表达的结果显示,与0g/L的ASP相比,0.10g/L的ASP增加Hepcidin表达(P<0.05),0.20g/L和0.40g/L的ASP降低Hepcidin的表达,呈现浓度依赖性(P<0.01或0.05).<br>　　用0.40g/L的ASP分别处理细胞0h、24h、48h、72h、96h后,RT-PCR方法分析Hepcidin mRNA表达的结果显示,0.4g/L的ASP处理细胞48小时后,Hepcidin表达显著降低(P<0.01),呈现时间依赖性.<br>　　通过Western blot方法分析用0.40g/L的ASP处理96小时或未处理的HepG2和L-O2细胞中Hepcidin表达的结果显示,用ASP处理的HepG2和L-O2细胞中Hepcidin的表达显著降低(P<0.01).<br>　　(2)ASP对体内Hepcidin表达的影响<br>　　Western blot方法检测4T1和H22荷瘤小鼠肝组织中Hepcidin表达的结果显示,与空白组相比,对照组中Hepcidin表达上调(P<0.01);与对照组相比,ASP组中Hepcidin的表达显著降低(P<0.01).IHC方法检测4T1和H22荷瘤小鼠肝组织中Hepcidin蛋白表达的结果也显示,与空白组相比,对照组中Hepcidin的表达显著增加(P<0.01),与对照组相比,ASP组中Hepcidin的表达显著降低(P<0.01).与Western blot结果一致.<br>　　ELISA方法检测ASP对每只荷瘤小鼠血清中Hepcidin的影响.<br>　　结果显示,对照组中4T1和H22荷瘤小鼠的Hepcidin水平分别比空白组增加1.78倍和1.82倍(P<0.01),与对照组相比,4T1和H22荷瘤小鼠的ASP组中Hepcidin水平分别降低54.55%和47.29%(P<0.01).<br>　　2.ASP对铁代谢相关因子的影响<br>　　ELISA方法检测4T1和H22荷瘤小鼠血清中的铁蛋白、Tf、TfR1、TfR2水平的结果显示(图2),与空白组相比,对照组4T1荷瘤小鼠血清中铁蛋白、Tf、TfR1、TfR2水平分别增加4.27倍(P<0.001)、3.45倍(P<0.001)、3.83倍(P<0.001)、1.43倍(P<0.05);与空白组相比,对照组H22荷瘤小鼠血清中铁蛋白、Tf、TfR1、TfR2水平分别增加3.30倍(P<0.001)、3.37倍(P<0.001)、3.09倍(P<0.001)、1.50倍(P<0.001).ASP治疗后,在4T1荷瘤小鼠中,与对照组相比,ASP组血清中铁蛋白、Tf、TfR1、TfR2水平分别下降50.73%(P<0.001)、12.20%(P>0.05)、69.36%(P<0.001)、30.90%(P<0.01);在H22荷瘤小鼠中,与对照组相比,ASP组血清中铁蛋白、Tf、TfR1、TfR2水平分别下降34.31%(P<0.01)、18.00%(P<0.05)、39.74%(P<0.01)、28.16%(P<0.001).<br>　　3.ASP对参与Hepcidin调控的信号蛋白的影响<br>　　(1)ASP对荷瘤小鼠血清和肝组织中IL-6的影响<br>　　ELISA方法测定4T1和H22荷瘤小鼠血清中IL-6水平的结果显示,4T1和H22荷瘤小鼠血清IL-6的水平分别比空白对照组增加2.21倍和2.10倍(P<0.01),与对照组相比,4T1和H22荷瘤小鼠中的ASP组IL-6的水平分别显著降低51.09%和33.83%(P＜0.01).Western blot方法分析4T1和H22荷瘤荷瘤小鼠肝组织IL-6表达的结果显示,与空白组相比,对照组中IL-6的表达显著增加(P<0.01);与对照组相比,4T1和H22荷瘤小鼠中的ASP组IL-6的表达显著降低(P＜0.01).与ELISA结果一致.<br>　　(2)ASP对荷瘤小鼠肝组织中JAK2、磷酸化STAT3、磷酸化Smad1/5/8表达的影响<br>　　Western blot方法分析4T1和H22荷瘤荷瘤小鼠肝组织中JAK2、磷酸化STAT3、磷酸化Smad1/5/8表达的结果显示,与空白组相比,对照组中的JAK2、磷酸化STAT3、磷酸化Smad1/5/8的表达显著增加(P＜0.01).ASP处理后显著降低肝组织中JAK2、磷酸化STAT3、磷酸化Smad1/5/8的表达(P＜0.01).<br>　　结论：<br>　　1.ASP可显著抑制Hepcidin在体外和体内的表达.<br>　　2.ASP可显著降低铁代谢相关因子(铁蛋白、Tf、TfR1、TfR2)的水平.<br>　　3.ASP可显著抑制参与Hepcidin调控信号蛋白的表达.