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摘要在肥胖和2型糖尿病等代谢性疾病中，糖、脂代谢发生紊乱,在肝脏、脂肪和骨骼肌等组织中会出现糖酵解和脂质合成异常。脂肪和肝脏是人重要的代谢器官，是机体代谢平衡的重要组成部分。代谢性疾病可以引起肝组织损伤,肝代偿性修复异常调节后导致肝纤维化（liver fibrosis）。哺乳动物Sirtuin家族中的一个重要成员，Sirtuin6（SIRT6），参与调控了包括代谢，炎症、衰老等许多重要生理功能。它在脂肪组织代谢平衡和肝脏疾病发生发展过程中的作用还不是很清楚。<br>　　目的：<br>　　本研究拟使用广泛应用于基因敲出的Cre-loxp系统建立两种SIRT6基因在脂肪细胞中敲除的小鼠模型，研究SIRT6在脂肪细胞中的功能；利用肝星状细胞的细胞系-LX2细胞以及SIRT6过表达（全身性）的转基因小鼠（TgSIRT6）为研究对象，研究SIRT6在肝星状细胞中的的作用。<br>　　方法：<br>　　1.研究SIRT6在脂肪细胞中的作用<br>　　（1）利用正常饲料和60%高脂饲料喂养野生型小鼠（wild-type，WT），建立肥胖小鼠模型，通过Western blot检测SIRT6在脂肪组织中的表达。<br>　　（2）利用SIRT6floxed（Sirt6flox/flox）的小鼠与Fabp4-cre小鼠交配，得到Sirt6f/f：Fabp4-Cre（SIRT6FKO）的小鼠。利用SIRT6floxed（SIRT6flox/flox）的小鼠与脂肪细胞特异性的Adipoq-cre小鼠交配，得到(Sirt6f/f：Adipoq-Cre（SIRT6AKO）的小鼠，即SIRT6成熟脂肪细胞特异性敲除的小鼠。通过Western blot和qRT-PCR检测SIRT6的敲除效率，选用SIRT6在脂肪组织中有效敲除的小鼠，即SIRT6FKO和SIRT6AKO小鼠进行研究。<br>　　（3）正常饲料喂养WT和SIRT6FKO雄鼠和雌鼠，3个月后处死小鼠，收集血液，取脂肪组织进行表型分型。<br>　　A.血清中甘油三酯和总胆固醇水平，采用商业化试剂盒进行测定。<br>　　B.小鼠体重和附睾脂肪（white adipose tissue，WAT）重量的称量。<br>　　C.脂肪组织石蜡切片采用HE染色分析脂肪组织的总体形态及脂肪细胞状况；提取棕色脂肪（brown adipose tissue，BAT）的总RNA，反转录后进行SYBR green实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）检测BAT中UCP1，PGC1α和PPARγ等基因的表达水平。<br>　　D.通过Western blot检测WT和SIRT6FKO小鼠胰岛素刺激下，WAT中AKT磷酸化水平。<br>　　（4）正常饲料喂养WT和SIRT6FKO进行葡萄糖耐量试验（glucose tolerance tests，GTT）和胰岛素耐量试验（insulin tolerance test，ITT）；通过qRT-PCR和Western blot检测胰岛素刺激或不刺激下小鼠WAT组织中AKT磷酸化、瘦素和脂联素的表达水平评估血糖平衡和胰岛素抵抗。<br>　　（5）运用qRT-PCR方法检测WAT和BAT组织中主要炎症因子F4/80，TNFα，IL-6和MCP-1表达。<br>　　（6）正常饲料喂养WT和SIRT6AKO雄鼠和雌鼠，检测体重变化。<br>　　（7）利用60%高脂饲料喂养WT和SIRT6AKO雄鼠和雌鼠，检测小鼠体重变化，进行葡萄糖耐量试验（glucose tolerance tests，GTT）和胰岛素耐量试验（insulin tolerance test，ITT）来评估血糖平衡和胰岛素抵抗。qRT-PCR方法检测WT和SIRT6AKO小鼠WAT和BAT组织中主要炎症因子TNFα，IL-6表达。<br>　　2.研究SIRT6在肝星状细胞中的作用<br>　　（1）采用人肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）细胞系（LX2细胞），用10ng/mL的TGFβ1处理LX2细胞不同的时间，qRT-PCR和Western blot检测SIRT6的mRNA水平和相关纤维化基因的表达。<br>　　（2）利用腺病毒介导SIRT6在LX2细胞中的过表达或利用shSIRT6的腺病毒在LX2细胞中敲低（knockdown）SIRT6，观察在TGFβ1处理或不处理的情况下，ACTA2，COL1A1，TIMP1等纤维化相关基因的表达水平。<br>　　（3）采用广泛应用的CCL4注射急性诱导肝纤维化的方法，构建肝纤维化的模型。qRT-PCR和Western blot检测SIRT6的mRNA水平和aSMA及相关基因的表达。<br>　　（4）利用SIRT6全身性过表达的转基因（TgSIRT6）小鼠，采用CCL4注射构建急性肝纤维化模型来研究SIRT6对肝纤维化的形成作用。<br>　　结果：<br>　　1.SIRT6在脂肪细胞中的作用<br>　　（1）高脂饲料喂养的小鼠与正常饲料喂养的小鼠相比，WAT中SIRT6表达水平下降(P＜0.05)。<br>　　（2）利用Fabp4-cre和Adipoq-cre小鼠，成功构建了SIRT6脂肪组织敲除小鼠（SIRT6FKO）和SIRT6脂肪组织特异性敲除小鼠（SIRT6AKO）。<br>　　（3）正常饲料喂养WT、SIRT6FKO雄鼠和雌鼠（6-8只/组），表型分析结果显示：SIRT6FKO小鼠表现出肥胖表型（P＜0.05）。<br>　　（4）正常饲料喂养WT、SIRT6FKO小鼠（7-9只/组），SIRT6FKO小鼠表现出葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗（P＜0.05）。<br>　　（5）与WT小鼠相比，SIRT6FKO小鼠WAT和BAT组织炎症反应增加（P＜0.05）。<br>　　（6）正常饲料喂养WT、SIRT6AKO雄鼠和雌鼠（6-8只/组），SIRT6AKO小鼠无肥胖表型。<br>　　（7）利用60%高脂饲料喂养WT和SIRT6AKO雄鼠和雌鼠（7-8只/组），SIRT6AKO小鼠无肥胖表型。<br>　　2.SIRT6在肝星状细胞中的作用<br>　　（1）SIRT6的表达在Tgfβ1诱导的LX2细胞分化过程中呈现明显的下调（P＜0.05）。<br>　　（2）SIRT6在LX2细胞中调控纤维化相关基因的表达（P＜0.05）。<br>　　（3）SIRT6的表达水平在CCL4诱导的纤维化肝脏中有显著降低（P＜0.05）。<br>　　（4）TgSIRT6小鼠能够抵抗CCL4所诱导的肝纤维化（P＜0.05）。<br>　　结论：<br>　　1.小鼠Fabp4阳性的细胞中敲除SIRT6能引发肥胖和胰岛素抵抗等代谢紊乱的表型。<br>　　2.SIRT6能够抑制肝星状细胞的激活从而抑制肝纤维化。