线粒体丙酮酸载体1在肾细胞癌进展中的作用与机制研究-论文-万方医学网

线粒体丙酮酸载体1在肾细胞癌进展中的作用与机制研究

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摘要肾细胞癌占肾脏恶性肿瘤的80% - 90%，其中透明细胞癌约占肾细胞癌的85%。尽管肾切除、免疫治疗和靶向治疗有了长足的进展，但仍有25 %-30 %的肾细胞癌患者预后很差。侵袭和伴随的转移在高级别肾癌患者中是不可避免，最终导致患者死亡的原因。因此，阐明肾细胞癌侵袭的机制对于寻找新的治疗策略至关重要。 　　越来越多的证据显示异常的线粒体代谢在肿瘤发生中起着关键作用，提示线粒体代谢相关的关键分子与肿瘤进展密切相关。线粒体丙酮酸载体( MPC )，包括两个成员，线粒体丙酮酸载体1（MPC1）和线粒体丙酮酸载体2（MPC2），是线粒体丙酮酸转运和氧化的守护者，且 MPC 的相关功能与癌症进展已经在多种癌症中被证实。例如，肿瘤细胞的 MPC 耗竭或被特定抑制剂阻断其活性导致有氧糖酵解和肿瘤细胞的侵袭性增强。已在结肠癌、前列腺癌和食管癌中证实，MPC蛋白表达的降低与各种癌症患者的生存时间呈负相关。在大肠癌细胞系中的过度表达 MPC 后，瘤细胞在小鼠体内的致瘤性显著降低。在结肠癌和食管癌中，MPC抑制了调节肿瘤细胞代谢的Warburg效应。在胆管细胞癌中研究发现，MPC1 是肝内胆管癌预后良好的指标，可抑制癌细胞侵袭和远处转移。这些数据表明 MPC 与肿瘤的预后及其侵袭转移密切相关。但其在肾细胞癌中的临床意义，作用和相关机制仍有待阐明。 　　本研究以肾透明细胞癌组织样本和肾细胞癌细胞系 786-O 为研究对象，阐明MPC1 在肾细胞癌进展中的作用及其机制。本研究发现，与癌旁组织相比，MPC1 在肾细胞癌组织中的表达明显下调，且其与肿瘤大小、晚期淋巴结转移和患者的总体生存率呈负性相关。下调MPC 1或使用MPC1的抑制剂，均可显著提高肾癌细胞的迁移和侵袭能力。相反，过表达 MPC1 可抑制肾癌细胞的迁移、侵袭及其体内成瘤能力。进一步的研究表明，体内缺氧微环境通过抑制肾癌细胞MPC1的表达可能引起HIF1α表达上升，且MPC1通过提高MMPs的活性，提高癌细胞的侵袭和迁移能力。 　　主要的结果结论如下： 　　1. MPC1在肾癌组织和癌旁组织的表达存在差异，在癌组织中呈低表达。 　　我们从GDS505基因表达谱芯片中筛选并获得了在肾癌组织和正常组织中有差异性的4个线粒体标记物基因，即，MPC1，TOMM6，TOMM7和细胞色素C（CYSC）。进一步在 10 例肾癌组织和癌旁组织中采用 qRT-PCR 进行验证，发现仅 MPC1mRNA的表达在癌组织和癌旁组织中的表达存在差异，呈低表达。MPC1和MPC2共同构成了MPC，我们采用Western blotting在12对肾癌组织和癌旁组织中进行MPC1和MPC2的检测，结果显示，癌组织中MPC1的表达水平与对应的癌旁组织相比明显降低。而MPC2在癌组织和癌旁组织中的表达无差异。同时对150例肾癌组织样本和30例癌旁组织进行免疫组化染色，发现癌组织中MPC1低表达病例的比例（60.67%，91/150）明显高于相应的癌旁组织（33.33%，10/30）。 　　2. MPC1是肾细胞癌的预后标记物。 　　(1) MPC1与肾细胞癌病人临床病理参数间的关系。 　　我们通过统计X-tile软件的相关风险分析确定了免疫组化评分的Cut-off值，根据此Cut-off值，将肾细胞癌病人样本分为 MPC1低表达组和MPC1高表达组。卡方检验表明，MPC1的表达水平与TNM分级（P=0.010）、年龄（P=0.001）呈负相关，与性别（P=0.254）、位置（P=0.950）、淋巴结转移（P=0.830）、组织学等级（P=0.628）无关。 　　(2) MPC1的表达与病人预后间的关系。 　　Kaplan-meier 对 150 例病人的生存分析显示，MPC1 低表达的肾细胞癌患者的生存时间明显短于MPC1高表达的肾细胞癌患者（P = 0.0016）。此外，通过对TCGA-数据库的164例肾癌患者的生存分析也表明，低表达MPC1的病人有较差的总生存时间（P=0.0128）。单因素和多因素分析进一步表明，低MPC1表达是肾癌患者整体生存率的独立预后指标（P=0.046；P=0.014）。 　　3.MPC1的缺失促进了肾癌细胞的生长与侵袭。 　　(1)MPC1在肾癌细胞的侵袭中发挥重要作用。 　　通过下调或过表达MPC1建立了MPC1下调和过表达的786-O细胞。Matrigel侵袭实验结果表明，MPC1的下调可提高肾癌细胞的侵袭能力。进一步的研究发现MPC抑制剂UK5099同样可提高786-O细胞的侵袭能力，而MPC1过度表达显著地降低了细胞的侵袭能力。 　　(2) MPC1通过影响基质金属蛋白的表达提高癌细胞的侵袭能力。 　　我们首先检测了肾癌细胞中的Vimentin和E-钙粘蛋白（E-cadherin）的表达，结果显示，MPC1 下调或者过表达对肾癌细胞这两个基因的表达无影响。进一步对基质金属蛋白酶的表达进行了检测，下调786-O细胞的MPC1后，细胞基质金属蛋白酶7（MMP7）和基质金属蛋白酶9（MMP9）在信使RNA水平和蛋白水平的表达均明显的升高；MPC 抑制剂 UK5099 也可提高肾癌细胞 MMP7 和 MMP9 的表达；过表达MPC1抑制细胞MMP7和MMP9的表达。 　　(3) MPC1通过将细胞阻断在G2期细胞生长来抑制肿瘤细胞的增殖。 　　采用CCK-8法对过表达或者下调MPC1的肾癌细胞的生长速度进行检测。结果显示过表达 MPC1 后，肾癌细胞的生长速度减缓。通过对细胞周期的检测发现过表达MPC1的细胞在G2期明显增多，表明MPC1过表达通过阻止G2期细胞的生长来抑制细胞的增殖。 　　(4) MPC1缺失可抑制肾癌细胞的体内成瘤能力。 　　我们通过皮下移植瘤检测 MPC1 在体内成瘤中的作用，我们发现移植过表达MPC1 的肾癌细胞后，肿瘤的平均重量和体积均较对照组明显降低。移植下调 MPC1的肾癌细胞后，其肿瘤的平均重量和体积均较对照组明显升高。且过表达MPC1的肾癌细胞所产生的MMP7与对照组相比明显减少。因此，体内实验证明，MPC1与肾癌细胞的成瘤能力密切相关。 　　4.MPC1/HIF1α参与了肾细胞癌的进展 　　(1) 缺氧能够提高肾癌细胞的迁移和侵袭能力，线粒体中的某系蛋白对低氧微环境敏感。因此，我们推测MPC1的表达可能受缺氧微环境的影响。我们用缺氧模拟剂氯化钴处理或在缺氧的条件下培养肾癌细胞，发现，缺氧能够降低MPC1的表达。 　　(2) 众所周知，HIF1α 是缺氧的重要调节因子，与肾癌的发生和发展密切相关。因此，我们研究了 MPC1 和HIF1α 之间的关系。发现 MPC1 的低表达可提高 HIF1α表达，而MPC1过表达可抑制HIF1α的表达。采用免疫组化染色法对肾癌病人样本进行检测，发现在MPC1低表达的患者样本中， HIF1α呈高表达，并在TCGA数据库中得到了证实。 　　结论： 　　1.筛选出线粒体生物标志物MPC1，MPC1在癌与癌旁中的表达有显著差异，且在肿瘤组织中的呈低表达。 　　2.低表达的MPC1与肿瘤进展和预后不良有关。该分子的表达水平与肿瘤的侵袭、TNM分期及患者的总生存时间水平呈负相关。MPC1是肾肿瘤病人的独立预后因素。 　　3.MPC1的缺乏促进了肿瘤在体内、外的进展，肾癌细胞通过MPC1的低表达不仅提高了基质金属蛋白酶的表达从而促进细胞的侵袭能力，且MPC1过表达能阻抑肾癌细胞生长周期于G2/M期，抑制肾癌细胞的增殖。 　　4.MPC1/HIF1α轴在肾癌的进展中发挥着关键作用。缺氧微环境通过抑制 MPC1的表达，导致HIF1α表达上调，进一步通过MMPs的表达促进细胞的侵袭能力。