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真姬菇SK-03菌丝体硒多糖结构及抗氧化、抗炎症分析

摘要硒是机体必不可少的微量元素,能参与多种酶的生理活动,保护生物膜的结构和功能免受氧化应激损伤。硒缺乏会导致炎症、心脑血管等疾病的发生。食用菌多糖具有抗氧化、增强免疫、预防肿瘤、延缓衰老等多种生物功效,被视为天然药物的重要来源。硒多糖是硒与多糖的有机结合,药理活性较高,易于吸收和利用。<br>  本课题对真姬菇(Hypsizygus marmoreus)SK-03菌丝体硒多糖(Mycelia selenium polysaccharides,MSPS)和菌丝体多糖(Mycelia polysaccharides,MPS)的结构进行初步分析,检测了MSPS在脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导炎症小鼠模型中的抗氧化和抗炎活性,初探了MSPS发挥器官保护作用的机制,旨在为天然抗炎药物的筛选提供新思路。主要结果如下:<br>  (1)确定了真姬菇SK-03菌丝体富硒培养基最适Na2SeO3浓度。结果表明,Na2SeO3最适添加浓度为3mg/L,此时真姬菇菌丝体的生物量、富硒率及硒含量分别为2.32±0.05g/L、21.62±1.44%和0.28±0.03mg/g。<br>  (2)真姬菇MSPS最佳提取参数优化。利用Plackett-Burman(PB)和响应面(Responsesurface methodology,RSM)试验确定了MSPS最佳提取条件为提取时间3h、乙醇浓度85%、乙醇倍数3倍,此条件下多糖得率为3.19±0.35%。经去色素、去蛋白、DEAE-52凝胶纤维素和葡聚糖凝胶柱层析、透析、冷冻干燥等步骤得到纯化后MSPS,其硒含量为68.79±3.46μg/g。<br>  (3)初步分析了MSPS和MPS结构。气相色谱(Gas chromatography,GC)结果表明,MSPS由鼠李糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成,摩尔比为0.009∶1.00∶0.20∶1.27∶2.84∶10.49。MPS由鼠李糖、岩藻糖、核糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成,摩尔比为0.53∶3.93∶0.28∶0.18∶2.23∶12.46∶6.40。通过高效液相色谱(High performance liquidchromatography,HPLC)分析,MSPS平均数均分子量为3.43×103Da,MPS为1.17×103Da。红外光谱(Fouriertransform infrared spectroscopy,FT-IR)分析,MSPS和MPS都存在α和β构型,其中MSPS为吡喃糖,MPS为呋喃糖。原子力显微镜(Atomforce microscope,AFM)扫描结果显示MSPS分散更均一,粒径更细小。<br>  (4)体外抗氧化活性测定。以羟基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率及还原力为指标,测定了MSPS和MPS体外抗氧化能力。结果表明,在0~3200mg/L范围内,随着浓度升高,抗氧化能力呈上升趋势,且相同浓度下,MSPS体外抗氧化能力强于MPS。<br>  (5)MSPS对炎症小鼠抗氧化、抗炎症及器官保护作用分析。通过腹腔注射LPS(5mg/kg)构建炎症小鼠模型,进行MSPS干预处理。结果表明,高剂量MSPS(800mg/kg)试验组小鼠器官保护效果最好,能显著提高小鼠肺、肝和肾中抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)酶活性和总抗氧化能力(Total antioxidantcapability,T-AOC);有效抑制各组织中脂质过氧化过程,降低脂质过氧化物(Lipid peroxidation,LPO)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的积累;血清中谷氨酰转肽酶(Glutamyltranspeptidase,GGT)、补体3(Complement3,C3)、超敏C反应蛋白(High-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)、肌酐(Creatinine,CRE)和尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)水平显著下降,血脂紊乱情况得到改善;血清中抗炎性细胞因子白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)水平显著上升,肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等促炎性细胞因子水平显著下降。细胞CM-H2DCFDA探针荧光染色,表明MSPS能有效降低肺、肝、肾细胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,进一步说明MSPS有较强的体内抗氧化能力。细胞凋亡分析发现MSPS(800mg/kg)可改善小鼠的细胞凋亡。上述结果表明MSPS具有抗氧化和抗炎症活性,能起到器官保护作用,组织病理学分析进一步验证了该作用。<br>  (6)MSPS介导ROS/TLR4/NF-κB信号途径发挥抗氧化、抗炎症及肺脏保护作用的初步分析。腹腔注射LPS(5mg/kg)构建小鼠肺炎模型,高剂量MSPS(800mg/kg)干预后,肺湿干重比(Wet/dry,W/D)和髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)活性显著降低,表明MSPS可减轻炎症反应。免疫印迹法证明MSPS处理后诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达降低,免疫组织化学分析证实MSPS的干预能提高肺组织中抗炎细胞因子IL-10水平。实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)和免疫印迹法对TLR4(Toll like receptor4,Toll样受体4)/NF-κB(Nuclear factor-κB,核转录因子)途径中关键基因和蛋白的表达水平进行了分析,发现MSPS能同时在两种水平上下调TLR4的表达。在上述作用共同影响下,MSPS能降低IKKβ(IκBKinase-β,IκB激酶β)活性,抑制IκB(Inhibitor ofκB,NF-κB抑制蛋白)降解,从而抑制NF-κB的激活,减少下游基因的表达。同时通过免疫组化手段发现NF-κB磷酸化水平降低,证实了NF-κB信号转导途径的激活被抑制。对下游信号分子进行分析,酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)结果表明肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)水平降低,同时MSPS可下调肺组织中IL-1β基因表达及TNF-α蛋白表达量。综上结果表明,MSPS能够通过调控ROS/TLR4/NF-κB信号转导途径发挥抗氧化和抗炎症作用,进而起到器官保护功能。

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