检索历史 清除

摘要哺乳动物生物钟作为一种重要的调控系统，存在于生物体几乎所有的组织和细胞中，通过调控生物钟控制基因节律表达维持生物体以接近24h为周期的各种生理功能变化。生物钟系统与动物配子发生、内分泌调控密切相关，小鼠睾丸间质细胞生物钟参与调控睾酮的合成，但具体的分子机制还不清楚。内质网作为真核细胞中蛋白质合成、折叠、分泌及储存Ca2+的重要场所，对维持细胞稳态及正常功能具有重要作用。UPR（未折叠蛋白反应）信号通路通过诱导miR211瞬时抑制生物钟基因Bmal1和Clock的表达，提供了内质网应激调控生物钟的直接证据。衰老的雄性哺乳动物血清睾酮含量下降，且伴随显著的内质网应激现象。综上所述，是否存在一条内质网应激调控生物钟信号通路，从而影响衰老小鼠睾丸间质细胞睾酮的合成，亟待进一步的深入研究。<br>　　本研究选用生物钟基因Bmal1敲除小鼠模型、小鼠胎儿成纤维细胞（NIH3T3）和小鼠睾丸间质细胞，利用免疫荧光染色、实时生物荧光测定系统、qPCR、Western blotting、ELISA和RNAi等技术，研究衰老引起的内质网应激通过小鼠睾丸间质细胞生物钟调控睾酮合成的分子机制。已获得的研究结果如下：<br>　　1.将杂合子Bmal1+/-小鼠经过交配繁育后得到一定数目的Bmal1-/-纯合子，Bmal1-/-小鼠体内未能检测到Bmal1基因mRNA和蛋白的节律性表达及分布，证明Bmal1基因在Bmal1-/-小鼠体内被彻底敲除。<br>　　2.生物钟蛋白BMAL1在小鼠睾丸间质细胞中存在节律性表达和分布，生物钟和睾酮合成相关基因在体外培养的小鼠睾丸间质细胞中存在节律性表达；Bmal1-/-小鼠血清睾酮含量显著降低，类固醇合成蛋白STAR表达降低，同时生物钟、睾酮合成以及与睾酮合成相关核受体基因在转录水平表达降低；生物信息学统计分析得出，与睾酮合成相关的类固醇基因启动子区域，存在生物钟基因调控的E-box和RORE元件，说明生物钟系统或许参与小鼠睾丸和间质细胞中一系列的生理活动，从而影响睾酮的分泌。<br>　　3.60nM Tg（类胡萝卜毒素）和60ng/mL Tm（衣霉素）能够诱导NIH3T3细胞激发内质网应激反应，抑制Bmal1-Luc的节律性振荡，抑制BMAL1蛋白的表达，抑制生物钟和生物钟控制基因转录水平的表达；内质网应激抑制剂4-PBA（4-苯基丁酸）能够减轻Tg和Tm诱导的NIH3T3细胞内质网应激积聚，部分恢复Bmal1-Luc的节律性振荡和生物钟基因转录水平的表达；干扰ATF4（而不是ATF6）可以部分恢复由Tg诱导的内质网应激对生物钟基因转录水平的抑制和Bmal1-Luc的节律性振荡的破坏。表明内质网应激的激活通过ATF4途径调控生物钟系统，进而影响NIH3T3细胞的生理机能。<br>　　4.衰老小鼠体内血清睾酮含量显著下降，衰老小鼠和衰老小鼠睾丸间质细胞系（TM3）中睾酮合成相关基因表达下调，内质网应激信号在蛋白和mRNA水平表达上调，生物钟基因在蛋白和mRNA水平表达下调，说明在衰老小鼠中，内质网应激可能通过直接调控生物钟系统的表达，影响睾酮的分泌。<br>　　5.60nM Tg和60ng/mL Tm能够诱导TM3细胞激发内质网应激反应，抑制Per2-dLuc的节律性振荡，抑制BMAL1蛋白的表达，抑制生物钟、生物钟控制基因和睾酮合成相关基因转录水平的表达；内质网应激抑制剂4-PBA能够减轻Tg诱导的TM3细胞内质网应激积聚，部分恢复Per2-dLuc的节律性振荡，生物钟和睾酮合成相关基因转录水平的表达；Tg诱导的内质网应激能够抑制小鼠睾丸间质瘤细胞（MLTC1）和分离培养的原代小鼠睾丸间质细胞（MLC）睾酮的分泌，生物钟、睾酮合成以及与睾酮合成相关核受体基因在转录水平表达。说明内质网应激通过影响小鼠睾丸间质细胞生物钟系统，从而影响睾酮的分泌。<br>　　上述结果证明，小鼠睾酮分泌受到生物钟系统的调控，内质网应激参与了生物钟系统的调节。衰老小鼠内质网应激升高造成生物钟紊乱，导致睾酮含量下降。该研究完善了生物钟-内质网应激影响小鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的调节作用，并从一个侧面解释了衰老造成的雄性动物睾酮分泌下降的机制。