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摘要本文主要从以下几方面进行论述：<br>　　第一部分:γδT细胞对皮肤移植免疫排斥反应的影响和机制研究<br>　　γδT细胞是除αβT细胞以外的另一群T细胞,在外周循环和淋巴器官中比例很小,但在皮肤中比例却较高.以小鼠为例,γδT细胞占皮肤表皮中T细胞比例的90％以上,占真皮中T细胞比例的一半.Vγ1、Vγ4和Vγ5T细胞是小鼠皮肤中驻扎的主要γδT细胞亚群,各自具有不同的生物学功能.Vγ5T细胞仅分布在表皮组织中,称表皮树突状T淋巴细胞(DETC),可分泌IGF-1、KGF等细胞因子维持皮肤稳态和促进创面愈合.Vγ1和Vγ4T细胞不仅分布于外周循环,也分布于皮肤的真皮层,可分泌IL-17A和IFN-γ参与皮肤自身免疫疾病、抗肿瘤免疫和感染免疫.然而,Vγ1和Vγ4T细胞对皮肤移植排斥的作用尚不清楚.<br>　　IL-17A是一强大的促炎细胞因子,可招募中性粒细胞和巨噬细胞,在炎症级联反应的起始阶段发挥重要作用.IL-17A主要来源于Th17细胞和γδT细胞.文献报道γδT细胞可在机体损伤后3h即分泌IL-17A;而Th17是适应性免疫细胞,需要抗原递呈细胞提高活化信号;因此,γδT细胞被认为在免疫反应早期(0-7天)分泌IL-17A,Th17发挥作用在其之后(7天之后).γδT细胞迁移至皮肤移植部位是否也依赖趋化因子-趋化因子受体CCL20-CCR6通路仍不清楚.此外IL-1β和IL-23可刺激γδT细胞产生IL-17A,对于炎症反应的启动和放大非常重要.因此,需要探究IL-1β和IL-23是否参与γδT细胞介导的皮肤移植排斥反应.<br>　　文献报道皮肤移植排斥反应主要由宿主同种异体反应性αβT细胞驱动,此外同种异体移植物的排斥导致的炎症反应强烈地诱发了局部的树突状细胞(dendritic cell,DC)成熟,然后转移到外周的引流淋巴结以激活特定抗原特异性αβT细胞.然而,γδT细胞来源的IL-17A是否促进成熟的DC在引流淋巴结(DLN)的聚集,以及对αβT细胞效应功能的调节需要进一步阐明.<br>　　结果:<br>　　1、Vγ4T细胞参与排斥反应,其主要在急性排斥反应的早期发挥作用.<br>　　将野生型小鼠皮肤移植至Tcrδ-/-小鼠背部,发现移植皮片存活时间明显延长;然而将Tcrδ-/-小鼠皮肤移植至野生型小鼠背部,移植皮片存活时间没有明显改变,提示宿主皮肤中而不是皮片中的γδT细胞参与皮肤移植排斥反应.将野生型小鼠的Vγ1T细胞或Vγ4T细胞分别清除,或将Vγ1T细胞、Vγ4T细胞分别回输至Tcrδ-/-小鼠移植创基,发现Vγ4T细胞比Vγ1T细胞对移植排斥反应的促排作用更为显著.分别在移植前3天或移植后10天清除雌性WT移植宿主体内的Vγ4T细胞,发现移植前清除Vγ4T细胞比移植后清除延长皮片存活的效果更明显,提示Vγ4T细胞主要在急性排斥反应的早期发挥作用.<br>　　2、Vγ4T细胞分泌IL-17促进皮肤排斥反应,以及依赖CCR6-CCL20通路浸润至表皮.<br>　　2.1、Vγ4T细胞分泌IL-17促进皮肤排斥反应.<br>　　在移植皮片周缘注射IFN-γ或IL-17A的中和抗体,或野生雄鼠的皮片移植至同周龄的雌性Ifn-γ-/-和Il-17a-/-小鼠背部,发现IL-17A比IFN-γ对皮肤排斥反应的作用更为显著.将Ifn-γ-/-和Il-17a-/-Vγ4T细胞分别回输至Tcrδ-/-小鼠移植创基,发现Ifn-γ-/-Vγ4T细胞显著加速排斥反应发生,而Il-17a-/-Vγ4T细胞无明显效应.通过WB和免疫组化检测Vγ4T细胞清除组与对照组移植皮片和移植周缘皮肤组织中的IL-17A的表达,结果显示Vγ4T细胞清除组在移植皮片和移植周缘皮肤组织中的IL-17A的表达均减少.因此,认为IL-17A是Vγ4T细胞促进皮肤排斥反应的主要介质.<br>　　2.2、Vγ4T细胞依赖CCR6-CCL20通路浸润至表皮.<br>　　在移植后第三天收集移植皮片和移植周缘的表皮组织,检测出Vγ4T细胞浸润表皮并且Vγ4T细胞表达CCR6.此外,移植皮片和移植周缘表皮组织中CCL20表达明显增多.而将野生型小鼠移植皮片周缘的CCL20中和后,皮片存活时间显著延长,Vγ4T细胞数量和IL-17A的表达量急剧减少.以上结果说明移植术后Vγ4T细胞通过CCR6-CCL20通路浸润至表皮.<br>　　第二部分:γδT细胞对创面愈合的影响和机制研究<br>　　γδT细胞是皮肤免疫防御的重要组成部分,参与银屑病、肿瘤、皮肤移植排斥、微生物感染和创面愈合等疾病.DETC特异性且专一性地表达Vγ5Vδ1TCR,仅分布在小鼠皮肤的表皮层.Vγ4T细胞是小鼠外周循环中的主要γδT细胞亚群,分布于皮肤组织但仅存在于真皮层.皮肤损伤后创缘的DETC可快速活化分泌IGF-1,是表皮组织IGF-1的主要来源,促进创面修复.Vγ4T细胞参与过敏反应、自身免疫疾病、抗肿瘤免疫和感染免疫.然而Vγ4T细胞是否影响创面愈合尚不清楚.<br>　　文献报道IL-17A对有效的创面愈合是必须的,可诱导表皮角质形成细胞表达抗菌肽β-防御素3(β-defensin3)和RegIIIγ.然而,Rodero MP等人报道了与之相反的结果,即IL-17A可能抑制创面愈合.在皮肤移植模型中,发现Vγ4T细胞可通过CCL20-CCR6通路从真皮迁移至表皮,是移植早期创缘组织IL-17A的主要来源.但Vγ4T细胞和IL-17A对皮肤创面愈合的作用有待进一步阐述.皮肤中的IL-1β和IL-23主要来源于角质形成细胞和朗格汉斯细胞.在γδT细胞介导的皮肤疾病中,IL-1β和IL-23可强烈促进γδT细胞分泌IL-17A.发现IL-1β和IL-23可诱导Vγ4T细胞加重皮肤移植排斥反应.有意思的是,移植区域的Vγ4T细胞产生的IL-17A可反过来增强表皮组织中IL-1β和IL-23的表达.然而,在创面愈合中IL-1β/IL-23是否影响γδT细胞表达IL-17A,尚未研究清楚.<br>　　结果:<br>　　1、Vγ4T细胞通过抑制DETC分泌IGF-1延迟创面愈合.<br>　　1.1、Vγ4T细胞通过作用于DETC延迟创面愈合.<br>　　分别清除野生型小鼠的Vγ4T细胞和Vγ1T细胞,发现Vγ4T细胞清除后创面愈合明显加速,而Vγ1T细胞清除后创面愈合没有明显改变,提示Vγ4T细胞可延迟创面愈合.然而将Vγ4T细胞回输至Tcrδ-/-小鼠背部创面并不能促进创面愈合,提示Vγ4T可能是间接影响创面愈合.文献报道DETC在创面愈合中发挥着重要的作用.将新鲜分离的DETC单独或者DETC与Vγ4T细胞的混悬液回输至至Tcrδ-/-小鼠的创基,后者与前者相比创面愈合延迟.这些结果提示Vγ4T细胞可能是通过DETC延迟创面愈合.<br>　　1.2、Vγ4T细胞抑制DETC分泌IGF-1从而影响创面愈合.<br>　　通过WB和免疫组化检测Vγ4T细胞清除鼠和对照鼠创周表皮中IGF-1的表达量,发现Vγ4T细胞清除后IGF-1表达明显提高.DETC回输至Tcrδ-/-小鼠创面可显著提高创周表皮中IGF-1的产量,但是Vγ4T细胞与DETC同时回输时IGF-1的表达量却不及DETC单独回输时增长的明显.Vγ4T细胞清除小鼠创缘注射rIGF-1可促进创面愈合,而给予IGF-1中和抗体会延迟创面愈合.<br>　　2、Vγ4T细胞分泌IL-17A并迁移至创缘表皮抑制创面愈合.<br>　　2.1、Vγ4T细胞依赖IL-17A抑制创面愈合.<br>　　检测正常小鼠及Vγ4T细胞清除小鼠创缘皮肤中IFN-γ和IL-17A的表达水平,发现皮肤损伤后IL-17A+Vγ4T细胞明显增多,Vγ4T细胞清除后IL-17A表达量明显下降;而IFN-γ无此类似改变.将Ifn-γ-/-小鼠、Il-17a-/-小鼠和Tcrδ-/-小鼠造创,及行细胞回输实验进一步探究Vγ4T细胞分泌何种细胞因子发挥作用,结果提示IL-17A而非IFN-γ是Vγ4T细胞延迟创面愈合的主要细胞因子.此外,在Vγ4T细胞清除后于创缘皮下注射rIL-17A可抑制创面愈合,而给予IL-17A中和抗体(20μg/创面)可显著促进创面愈合.<br>　　2.2、Vγ4T细胞是皮肤损伤后表皮中IL-17A的主要早期来源,通过CCR6-CCL20从真皮迁移至表皮.<br>　　通过检测皮肤损伤后创缘表皮、真皮及引流淋巴结中Vγ4T细胞比例,发现皮肤损伤后Vγ4T细胞比例在表皮明显上升,在真皮却下降,而引流淋巴结中无明显改变.检测创缘表皮中表达IL-17A的细胞亚群,发现超过50%的IL-17A+T细胞为Vγ4T细胞,仅少于5%的IL-17A+细胞为DETC.Vγ4T细胞清除后表皮组织中IL-17A的表达量明显减少,而真皮中的IL-17A表达量无明显变化.<br>　　综上所述,Vγ4T细胞在皮肤创伤早期通过CCR6-CCL20通路从真皮迁移浸润至表皮,是创缘表皮组织中IL-17A的主要来源,导致创面愈合延迟.此外,Vγ4T细胞来源的IL-17A通过增强表皮组织中IL-1β/IL-23的表达,间接阻碍DETC产生IGF-1.IL-1β/IL-23通过激活NF-κb和STAT3信号通路阻碍IGF-1的表达,其中IL-1β活化NF-κb信号通路为更重要的调控IGF-1的机制.本课题研究聚焦于Vγ4T细胞对创面愈合的影响以及Vγ4T细胞对DETC的调控机制,对创面愈合理论提供了有益补充,为今后促进人类创面早期修复的研究和治疗提供了新靶点和新思路.