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摘要目的<br>　　在前期研究的基础上，通过建立慢性应激大鼠模型，采用“解郁育胞方”进行干预治疗，进一步验证解郁育胞改善慢性应激大鼠子宫内膜容受性的作用，并初步探讨其作用机制，为解郁育胞方在临床中的应用提供可靠的实验依据。<br>　　方法<br>　　采用慢性轻度不可预见性应激造模法来建立慢性应激大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为五组，分别为：模型对照组、西药对照组、中药低剂量组、中药中剂量组和中药高剂量组，另设正常对照组。各组给药方法如下：<br>　　正常对照组：灌服等体积纯化水11.2ml/kg，每日1次，连续14日；模型对照组：灌服等体积纯化水11.2ml/kg，每日1次，连续14日；西药对照组：灌服阿司匹林，剂量6.75mg/kg，每日1次，连续14日；中药低剂量组：灌服解郁育胞方，剂量5.6g/kg，每日1次，连续14日；中药中剂量组：灌服解郁育胞方，剂量11.2g/kg，每日1次，连续14日；中药高剂量组：灌服解郁育胞方，剂量22.4g/kg，每日1次，连续14日。<br>　　实验分为五个部分。第一部分为：慢性应激大鼠模型的建立与评价。通过连续21天给予慢性轻度不可预见性应激来建立慢性应激大鼠模型，并观察造模前后大鼠行为学（包括一般行为和糖水摄取率、强迫游泳静止时间）及血清皮质酮（CORT）的变化对模型进行评价。第二部分实验为：解郁育胞方对慢性应激大鼠围着床期雌、孕激素水平，子宫内膜厚度、组织形态及容受性的影响。各组大鼠分别于给药14日后选择动情期按雌雄2:1合笼，次日晨9:00时检查阴栓，无阴栓者进行阴道涂片检查，发现阴栓或涂片发现精子者记为妊娠第1日。妊娠第4日每组各取6只大鼠处死取标本，各组余下的10只大鼠用于后续实验。通过HE染色观察大鼠子宫内膜厚度及组织形态变化；采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血清雌、孕激素水平；通过免疫组织化学法检测子宫内膜LIF的表达水平。第三部分实验为：解郁育胞方对慢性应激大鼠围着床期Wnt/β-catenin信号通路的影响。将实验二采集的大鼠子宫标本，通过Westernblot检测大鼠子宫内膜Wnt/β-catenin信号通路主要蛋白Wnt7a、HOXA10、β-catenin和p-β-catenin的表达水平；用qRT-PCR检测大鼠子宫内膜Wnt/β-catenin信号通路相关基因Wnt7a及β-catenin的mRNA表达水平；并采用免疫荧光法检测大鼠子宫内膜p-β-catenin蛋白的定位及表达水平。第四部分实验为：解郁育胞方对慢性应激大鼠围着床期LPAR3及COX-2的mRNA表达的影响。将实验二采集的大鼠子宫标本，通过qRT-PCR法检测大鼠子宫内膜LPAR3和COX-2mRNA的表达水平。第五部分实验为：解郁育胞方对慢性应激大鼠妊娠功能的影响。将实验二各组余下的10只大鼠于妊娠第10日16：00全部颈椎脱臼法处死，剖取子宫，观察受孕情况并统计胚胎数。<br>　　HE染色、免疫组织化学染色以及免疫荧光的切片采用显微镜采集图像。先直接观察子宫内膜的细胞形态及蛋白表达定位，在通过Image-proplus6.0图像分析系统进行分析，利用该软件测量子宫内膜的厚度，计算特异蛋白的平均光密度值（平均光密度=累积光密度IOD/面积区域）。<br>　　Westernblo利用胶片曝光后通过扫描获得实验图像，使用BandScan分析胶片灰度值。以目标蛋白与内参蛋白灰度的比值作为该蛋白的相对表达量进行统计分析。<br>　　qRT-PCR用ABI公司QuantStudio?6Flex实时荧光定量PCR系统检测目标基因mRNA的表达水平，以正常对照组为基准，利用2-△△Ct的分析方法分析各目标基因mRNA的相对表达量。<br>　　所有数据均用SPSS19.0软件包进行处理，数据资料以-x±s形式表示，组间比较采用独立样本的T检验统计方法，多重比较采用比较均值的单因素方差分析法，P＜0.05为差异有统计学意义。<br>　　结果<br>　　1.慢性应激大鼠模型的建立与评价<br>　　慢性应激会使大鼠发生行为学的相关改变，如抬举、抓痒、添足等修饰行为减少，糖水摄取率降低，强迫游泳静止时间增加，还会使大鼠血清皮质酮（CORT）的含量升高。在对慢性应激大鼠模型进行评价时可以将糖水摄取率降低20%、强迫游泳静止时间增加20%、血清皮质酮含量显著升高为定量评价指标。<br>　　2.解郁育胞方对慢性应激大鼠围着床期雌（E2）、孕激素（Pg）水平，子宫内膜组织形态及容受性的影响<br>　　解郁育胞方能够提高慢性应激大鼠血清雌（E2）、孕激素（Pg）水平，增加子宫内膜厚度以及LIF的表达水平，且呈一定的剂量依赖性。中药各剂量组与模型对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；中药高剂量组与西药对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　3.解郁育胞方对慢性应激大鼠Wnt/β-catenin信号通路的影响<br>　　解郁育胞方能够提高慢性应激大鼠Wnt7a、HOXA10、β-catenin、P-β-catenin蛋白的表达水平及Wnt7a、β-catenin的mRNA表达水平，且呈现出一定的剂量依赖性。中药各剂量组与模型对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；中药高、中剂量组与西药对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　4.解郁育胞方对慢性应激大鼠围着床期LPAR3及COX-2的mRNA表达的影响<br>　　解郁育胞方能够提高慢性应激大鼠的COX-2及LPAR3的mRNA表达水平，且呈一定的剂量依赖性。中药各剂量组与模型对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；中药高、中剂量组与西药对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　5.解郁育胞方对慢性应激大鼠妊娠功能的影响<br>　　解郁育胞方中、高剂量组和西药对照组大鼠的平均胚胎数均高于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；解郁育胞方低剂量组大鼠平均胚胎数也高于模型对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。<br>　　结论<br>　　解郁育胞方能够调节慢性应激大鼠血清雌激素（E2）及孕激素（Pg）水平；增加慢性应激大鼠子宫内膜厚度和LIF的表达水平；同时还能促进Wnt/β-catenin信号通路上关键蛋白和基因的表达；增强LPAR3和COX-2的mRNA表达；从而改善慢性应激大鼠的子宫内膜容受性，提高大鼠的胚胎着床数改善其妊娠功能。