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摘要目的：对PD-1/PD-L1信号通路在骨肉瘤中的作用机制进行研究，观察阻断PD-1/PD-L1信号通路对骨肉瘤的治疗效果，为无法手术切除的骨肉瘤患者探索可能的免疫治疗方法。<br>　　方法：<br>　　第一部分：采用免疫组化法和qRT-PCR法检测6例新鲜人骨肉瘤标本中瘤组织和瘤旁组织PD-L1的表达，检测PD-L1在人骨肉瘤组织和其瘤旁组织中表达的差异。<br>　　第二部分：将人 PD-L1基因导入K7M2细胞中构建表达 PD-L1的 K7M2细胞（ K7M2-LV)。将K7M2-LV细胞注射入小鼠背部皮下建立肿瘤模型，应用来自动物模型的外周血流式分选CD4/CD8-PD-1+和CD4/CD8-PD-1－T淋巴细胞，将所得的两种淋巴细胞与 K7M2-LV和 K7M2空载细胞（K7M2-NC）分组共培养，CCK-8检测K7M2细胞的活力。分别使用顺铂、PD-1单克隆抗体及顺铂+PD-1单克隆抗体药物干预各组共培养细胞，流式细胞分析K7M2细胞的凋亡情况。上述药物分组干预后行细胞免疫组化染色，运用图像分析软件（ Image-Pro Plus6.0）进行图像分析，研究每个药物干预组中PD-L1表达差异。<br>　　第三部分：K7M2-LV注射入小鼠背部皮下建立动物模型，将荷瘤动物模型分为对照组、顺铂组、PD-1单克隆抗体组和联合组。各组骨肉瘤动物模型分别进行药物干预后测量小鼠瘤径，统计分析其数据差异情况。药物干预后的各组行流式细胞分析各干预组脾单核细胞中CD4+CD25 Treg淋巴细胞数量变化情况，了解各干预药物对骨肉瘤动物模型Treg淋巴细胞的影响情况。<br>　　结果：<br>　　第一部分：PD-L1免疫组化检查发现，6例病理标本中有4例染色为阳性，且有3例为强阳性，瘤旁组织染色为阴性。再将标本的肿瘤组织及瘤旁组织行 qRT-PCR检测结果行统计学分析发现：瘤组织中 PD-L1明显高于瘤旁组织，且具有统计学意义(p＜0.05）。<br>　　第二部分：PD-L1基因导入到K7M2中的转染条件为：Eni. S+Polybrene，MOI=20。行qRT-PCR验证显示，K7M2-LV细胞PD-L1表达明显高于K7M2-NC细胞，且具有统计学意义(p＜0.05）。动物模型外周血行流式分选技术分选得到 CD4 / CD8-PD-1 +和 CD4 /CD8-PD-1-淋巴细胞， CCK-8 检查淋巴细胞分别与 K7M2- LV 及K7M2- NC分组共培养组中细胞的活力发现：K7M2-LV+CD4/CD8-PD-1+共培养组中K7M2-LV细胞增殖最为明显（p＜0.05）。流式细胞分析药物干预共培养各组细胞的凋亡情况后行统计学分析发现：顺铂+PD-1单克隆抗体对 K7M2-LV+CD4/CD8-PD-1+共培养组中K7M2-LV细胞影响最为明显，且具有统计学意义（p＜0.05）。上述药物分组干预后行K7M2-LV细胞PD-L1免疫组化染色，并运用图像分析软件（ Image-Pro Plus6.0）分析显示：顺铂+PD-1单克隆抗体组 PD-L1免疫组化染色最低，且具有统计学意义(p＜0.05）。<br>　　第三部分：各组药物干预后小鼠瘤径统计分析发现：顺铂+PD-1单克隆抗体组瘤径最小，且具有统计学意义（p＜0.05)。荷瘤动物模型药物干预后行流式技术分析发现：各组CD4+CD25 Treg淋巴细胞浸润无统计学意义（(p＞0.05）。<br>　　结论：<br>　　第一部分：人骨肉瘤组织病理学标本 PD- L1免疫组化及qRT-PCR检测显示：PD-L1在大多数骨肉瘤标本中均有表达，这表明PD-L1表达可存在于人骨肉瘤中。<br>　　第二部分：淋巴细胞分别与 K7M2-LV及 K7M2-NC分组共培养后，CCK-8检测发现：K7M2-LV+CD4/CD8-PD-1+T淋巴细胞共培养组共同作用可抑制K7M2-LV细胞凋亡、促进细胞增殖。通过流式细胞术分析每组中药物干预的细胞共培养发现：顺铂与PD-1单克隆抗体联合应用有助于 K7M2-LV和 CD4/CD8-PD-1+T淋巴细胞共培养组中K7M2-LV细胞的凋亡，阻断 PD-1/PD-L1途径具有阻断细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。<br>　　第三部分：将动物模型分组行药物干预发现，联合用药可有效抑制骨肉瘤的生长。流式细胞分析CD4+CD25+Treg淋巴细胞数量后显示：各组药物对其数量无明显影响。