检索历史 清除

摘要第一部分 cTnIR193H突变致限制性心肌病小鼠钙调节基因和蛋白表达异常<br>　　目的：心肌肌钙蛋白I（cTnI）R193H基因突变可致限制性心肌病（RCM），心肌细胞对钙敏感性增高是RCM 心肌舒张功能障碍的关键因素，但其机理不明。磷酸二酯酶（PDE）是调控心肌细胞对钙敏感性的重要因子，其能够水解细胞内 cAMP 的功能，影响 PKA 及其下游诸多钙调蛋白，从而直接影响心肌细胞对钙的敏感性。本部分研究将阐明cTnIR193H突变RCM小鼠心肌中，PDE及cAMP、PKA等钙调节基因和蛋白的表达情况。<br>　　方法：（1）通过cTnI-knockout C57小鼠及cTnIR193H（193）RCM小鼠杂交产生cTnIR193H+cTnI-knockout（193+KO）RCM小鼠。以野生型C57小鼠、193小鼠、193+KO小鼠为研究对象，193+KO小鼠由于cTnIR193H突变蛋白更多，因此RCM相关症状比193小鼠更重。与通过高频超声检测各组小鼠心率。（2）通过q-PCR技术及western blot技术检测各组小鼠心肌PDE4D基因和蛋白的表达，PKA相关钙调节基因的表达，以及PKA、Ryr2磷酸化水平的检测。通过Ellisa技术检测各组小鼠心肌组织 cAMP 的水平。（3）以原代心肌细胞为研究对象，分为空转组，PDE4D低表达组和cTnIR193H过表达组。利用cytation5仪器观察 PDE4D 低表达心肌细胞和过表达 cTnIR193H 的心肌细胞搏动速率。<br>　　结果：（1）与野生型C57小鼠相比，193小鼠及193+KO小鼠心率增快（p＜0.05）。（2）193+KO小鼠钙调节基因PKAcα、PKAcβ、Ryr2表达显著高于野生组（p＜0.05），而PDE基因亚型PDE1B和PDE4D均较野生组显著降低，且PDE4D降低更明显（p＜0.05）。193+KO小鼠心肌PDE4D蛋白水平降低（p＜0.05），PKA和Ryr2蛋白磷酸化水平较野生组显著升高（p＜0.05）。（3）193+KO小鼠心肌组织cAMP水平较野生组明显升高（p＜0.05）。（4）过表达 cTnIR193H 的原代心肌细胞与 PDE4D 低表达的心肌原代细胞较对照组均出现了搏动加快（p＜0.05）。<br>　　结论：cTnIR193H突变RCM小鼠PKA信号通路活化引起心率增快可能与PDE4D低表达相关。<br>　　第二部分 组蛋白乙酰化修饰参与cTnIR193H限制性心肌病小鼠PDE4D低表达的调控<br>　　目的：第一部分研究发现，cTnIR193H突变 RCM小鼠PDE4D低表达可能是引起PKA相关钙调节基因改变的主要原因。但PDE4D低表达机制并不清楚。组蛋白修饰是表观遗传学常见的调控机制之一，有研究显示 PDE 受组蛋白修饰调控。本部分将以 cTnIR193H 突变RCM小鼠为研究对象，初步探讨RCM小鼠心肌PDE4D低表达的组蛋白修饰调控机理。<br>　　方法：（1）研究对象及分组为野生鼠，193 和 193+KO 鼠。通过ChIP 技术检测各组小鼠心肌中 PDE4D 基因启动子区域组蛋白乙酰化及甲基化水平。（2）qPCR检测各种组蛋白乙酰化酶、去乙酰化酶、甲基化酶的基因表达水平。（3）通过 CoIP 实验，筛选可以与 cTnI 相互作用的组蛋白修饰酶。（4）通过ChIP技术检测各组小鼠心肌中PDE4D基因启动子区域HDAC1和SMYD1的结合水平。<br>　　结果：（1）与野生组相比，193+KO小鼠PDE4D启动子区域H3K4、H3K9乙酰化水平以及H3K4三甲基化水平明显降低，差异具有统计学意义（p＜0.05）。（2）与野生组相比，组蛋白去乙酰化酶 HDAC8 和HDAC9 mRNA在193+KO小鼠中表达增加（p＜0.05），HDAC3 mRNA表达降低（p＜0.05），HDAC1 和 HDAC2 mRNA表达组间无差异（p＞0.05），组蛋白乙酰化酶GCN5及组蛋白甲基化酶SMYD1 mRNA在193+KO小鼠中表达增加，差异具有统计学意义（p＜0.05）。（3）CoIP显示 HDAC1阳性。（4）与野生组相比，193+KO小鼠PDE4D基因启动子区域，组蛋白去乙酰化酶HDAC1和组蛋白甲基化酶SMYD1的结合水平均增加（p＜0.05）。<br>　　结论：（1）193+KO小鼠心肌组织PDE4D的降低，可能由HDAC1介导的组蛋白H3K4和H3K9乙酰化修饰调控。（2）cTnIR193H突变蛋白可能通过与HDAC1蛋白互作从而调控PDE4D的表达。<br>　　第三部分 cTnIR193H通过HDAC1介导组蛋白乙酰化修饰调控PDE4D低表达<br>　　目的：第二部分研究提示PDE4D的低表达可能与HDAC1介导的组蛋白乙酰化修饰相关。作为RCM发病的始发因素，cTnI可与HDAC1相互作用。那么，cTnIR193H突变是否通过HDAC1介导，调控PDE4D的低表达？本部分研究将在进一步验证 HDAC1 调控 PDE4D 的基础上，阐明cTnIR193H调控PDE4D的内在机理。<br>　　方法：（1）以原代心肌细胞为研究对象分为空转组（NC），过表达 HDAC1 组（AV-HDAC1），过表达 cTnI 组（AV-cTnI）及过表达cTnIR193H组（AV-cTnIR193H），通过qPCR和WB检测PDE4D基因和蛋白的表达。（2）通过ChIP，检测PDE4D基因启动子区域cTnI、cTnIR193H、HDAC1结合水平及H3K4、H3K9乙酰化水平。（3）通过免疫荧光技术，证明cTnI入核。通过WB比较cTnI和cTnIR193H的入核能力。（4）通过CoIP技术，比较cTnI和cTnIR193H与HDAC1的结合能力。（5）以 293A 细胞为研究对象，分为空载组，cTnI 组及cTnIR193H 组。通过荧光酶素报告实验，检测 cTnI 和 cTnIR193H 对PDE4D启动子区域的转录活性。<br>　　结果：（1）与NC组比较，HDAC1过表达组PDE4D蛋白水平明显降低（p＜0.05），PDE4D 基因启动子区域 HDAC1 的结合水平显著增加，H3K4和H3K9乙酰化的水平显著降低，差异具有统计学意义（p＜0.05）。（2）心肌细胞核可观察到cTnI入核，且核内 cTnI和cTnIR193H的量无明显差异（p＞0.05）。（3）与空转组比较，cTnI对PDE4D启动子上游2000bp的荧光值增加（p＜0.05）。而cTnIR193H对PDE4D启动子上游2000b的荧光值没有明显的改变（p＞0.05）。（4）与空转组比较，过表达 cTnIR193H 后 PDE4D 基因和蛋白的表达显著降低（p＜0.05）。过表达cTnI后PDE4D mRNA水平明显增加（p＜0.05），但蛋白水平没有明显改变（p＞0.05）。（5）cTnI 和 cTnIR193H 均能结合PDE4D启动子区域，且相对结合量无明显差别（p＞0.05）。与cTnI组相比，cTnIR193H组PDE4D启动子区域HDAC1结合水平明显增加，且H3K4、H3K9乙酰化水平显著降低（p＜0.05）。（6）与cTnI相比， cTnIR193H 结合 HDAC1 的量明显增高，差异具有统计学意义（p＜0.05）。<br>　　结论：cTnIR193H突变通过与HDAC1相互作用，增加PDE4D启动子区域HDAC1结合水平，降低acH3K4和acH3K9的水平，从而抑制PDE4D基因和蛋白的表达。<br>　　第四部分 EGCG抑制cTnIR193H与HDAC1结合而改善cTnIR193H突变致PDE4D低表达<br>　　目的：第三部分研究提示HDAC1介导cTnIR193H调控PDE4D低表达。我们前期研究发现EGCG可抑制HDAC1介导的组蛋白乙酰化修饰从而提高基因的表达，且EGCG对cTnIR193H限制性心肌病小鼠心功能有明显的改善作用。因此本部分选择EGCG作为干预剂，明确EGCG对cTnIR193H突变致PDE4D低表达的改善作用，并探讨其内在机理。<br>　　方法：（1）以原代心肌细胞为研究对象，分为空转组、cTnIR193H组和cTnIR193H+EGCG干预组，通过q-PCR和WB技术检测PDE4D基因和蛋白的表达。（2）通过ChIP技术检测各组PDE4D启动子区域HDAC1结合水平和cTnIR193H结合水平。（3）通过CoIP技术，检测EGCG对cTnIR193H和HDAC1结合力的影响，以及EGCG对HDAC1活性的影响。<br>　　结果：（1）与对照组相比，cTnIR193H组PDE4D基因和蛋白水平降低（p＜0.05），EGCG干预后，PDE4D表达水平较cTnIR193H组显著增加（p＜0.05）。（2）与对照组相比，cTnIR193H组PDE4D启动子区域 HDAC1 结合量增加（p＜0.05）。EGCG 干预后 cTnIR193H 组PDE4D 启动子区域 cTnIR193H 和 HDAC1 结合水平显著降低（p＜0.05），acH3K4及acH3K9水平显著增加（p＜0.05）。（3）与cTnIR193H组比较，EGCG干预后cTnIR193H与HDAC1的结合量明显降低，差异具有统计学意义（p＜0.05）。（3）各组HDAC1的活性没有明显的改变（p＞0.05）。<br>　　结论：EGCG通过抑制PDE4D启动子区域cTnIR193H与HDAC1结合而改善cTnIR193H突变致PDE4D低表达。