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摘要第一部分 特应性皮炎血清脂溶性维生素水平的分析<br>　　背景：有研究表明，维生素D（VDD）缺乏与特应性皮炎（AD）有关，VD可能经过调节免疫、影响皮肤屏障功能途径在AD发病中起到保护作用。但很少有研究探讨 AD 与其他脂溶性维生素，特别是维生素A（VA）、维生素E（VE）之间的关系。VA、VE在维持皮肤生理功能发面同样发挥重要作用。<br>　　目的：检测 AD患儿血清 VA、VD、VE水平，探讨 VA、VD、VE与AD严重程度的相关性，为AD的临床治疗提供更多依据。<br>　　方法：根据Hanifin-Rajka标准，于2013年-2015年收集2-12岁儿童 AD 患者，以同时期年龄性别均匹配的健康儿童作对照；应用SCORAD方法评估AD疾病严重程度；酶联免疫法检测血清总IgE水平；血细胞分析仪检测嗜酸性细胞绝对计数值；高效液相色谱法测定血清VA、VD水平，高效液相质谱色谱法测定血清VE水平。<br>　　结果： 共纳入AD患者81例，健康对照65例，性别和年龄是匹配的(P=0.572 ， P=0.5845)。AD 患儿 SCORAD 评分(45.48 ± 13.36)(22~74.36)，中度者33例(40.7%)，重度患者48例(59.3%)。AD患者血清VD水平为(34.37±8.52 nmol/L)，显著低于健康对照(50.70±15.65 nmol/L，P＜0.001）；重度AD组和中度AD组的维生素D水平有显著差异(38.17±9.28 nmol/L,31.75±6.91 nmol/;P=0.0006)。AD患儿血清维生素A水平为(0.87±0.25 μmol/L)，明显低于健康对照(0.96±0.24 μmol/L，P=0.0423)；中度和重度两组维生素 A 水平无差异(0.9312± 0.2587μmol/L, 0.8292±0.2412μmol/L;P=0.073)。维生素E在AD患儿和健康对照组均值分别为：19.8±5.61μmol/L, 20.59±5.1μmol/L，两组差异无显著性(P=0.3758)。VD 和 VA 水平与 SCORAD 评分呈负相关(r=-0.3880,P＜0.001;r=-0.4203,P＜0.001)。维生素 E 水平与疾病严重度SCORAD无相关。AD组VD缺乏/不足和VA缺乏/不足儿童比例分别为96.3%,74.1%，健康对照组VD缺乏/不足和VA缺乏/不足儿童比例分别为67.7%和58.5%。维生素D和维生素A共同缺乏的AD患者比例为71.6%，其疾病严重程度SCORAD评分明显高于其他组AD。AD患者血清总 IgE 水平和嗜酸性粒细胞计数明显高于健康对照组，且与疾病严重程度呈正相关。AD患者血清总IgE水平与VA或VD水平无相关性。然而，外周血嗜酸性粒细胞计数与血清 VA 和 VD 之间负相关(r=-0.2385 P=0.0367;r=-0.2498 P=0.0264)。<br>　　结论：AD儿童存在VD和VA缺乏，VE水平正常。VD和VA缺乏程度与病情程度有关。VD和VA共同缺乏可加重儿童AD的临床表现，可能与 VA 和 VD 缺乏，影响皮肤固有免疫、屏障功能以及体内嗜酸性细胞自发活化增多，导致皮肤炎症加重有关。<br>　　第二部分 维生素D辅助治疗特应性皮炎安全性和疗效研究<br>　　背景：越来越多研究证明VD缺乏与AD发生有关，尤其是在AD儿童中。补充 VD 辅助治疗 AD 似乎是一种新的、安全的办法。但目前获得试验证据并不一致，而新近的两项meta分析VD补充能缓解AD的症状。<br>　　目的：以补充不同剂量、不同补充方式、不同类型的 VD 的补充方式，全面涛涛补充 VD 治疗儿童 AD 的安全性和有效性，旨在寻找AD患儿VD补充的最佳方式、VD补充最佳剂量，疗程以及VD补充后需要达到的目标。<br>　　方法：以符合Hanifin-Rajka标准，且血清VD水平小于50nnmol/L的AD患儿为研究对象，随机分为四组，VD0组仅接受基础治疗（艾洛松每晚一次，连续 2 周后停止，后续仅给润肤治疗），其余三组除了接受基础治疗之外，VD1 组每日口服 VD3800IU）、VD2 组每日口服VD32000IU、VD3组每月肌注VD2 10万单位。在补充后1月、3月两个时间点进行随访，了解补充过程出现的副反应，并检测患儿肝功、肾功、血钙（Ca）、血磷（Pi）、碱性磷酸酶（AKP）以及甲状旁腺素(PTH)，评判VD补充的安全性；每次随访测定患儿VD水平、对患儿疾病严重程度（用SCORAD表示，分数高表示病情更重）进行评分，了解VD补充有效性。<br>　　结果：整个补充过程中没有明显的不良事件发生。所有接受 VD补充的AD患儿肝功、肾功均正常。补充维生素D剂量为800 单位和2000 单位时，对血钙、血磷以及甲状旁腺素基本无影响，无论补充前还是补充后1月、3月，上述指标的血清水平变化均无明显的差异。补充剂量为10万单位时对体内血清钙、甲状旁腺素有影响，但都在正常范围内波动，血清钙水平在该剂量影响下 1 月时会显著上升，同样在该剂量影响下，甲状旁腺素在补充后一个月出现显著下降。随着时间推移，在接受补充治疗 3 月时，机体的自身调整，血钙、甲状旁腺素水平能回到之前的状态，使机体再次处于稳态中。<br>　　VD0组、VD1组、VD2组、VD3组在基线时体内维生素D水平分别为：30.57±4.05 nmol/L、34.24±5.36 nmol/L、32.94±7.68 nmol/L、32.53±4.85 nmol/L，各组之间VD基线水平无差异（P=0.2678）。除了VD0组，接受维生素D干预各组在1月后体内维生素D水平自身前后比较VD水平显著上升。干预组各组维生素D水平与VD0组相比，其血清 VD 水平均显著升高（P＜0.001）。VD1 组水平为：41.61± 6.61nmol/L，其中有2例（14.3%）患儿维生素D水平大于50nmol/L；VD2组维生素D水平均值为：44.01±6.05 nmol/L，3例（18.8%）维生素D水平大于50 nmol/L；VD3组血清维生素D水平为：39.37±7.60 nmol/L，大于50nmol/L的患儿仅1例。接受VD补充的各组在1月时两两比较，VD水平无差异。<br>　　3 月时，各组维生素 D 均显著上升（P＜0.001）。VD0 组经过 3月随访，VD水平为33.37±5.60 nmol/L，仅有1（4.76%）例患儿维生素D水平超过50nmol/L。VD1组均值为：44.32±7.74 nmol/L，5例（35.7%）患儿达到正常水平；VD2 组维生素 D 水平：60.16±8.05 nmol/L，14例AD患儿（87.5%）维生素D水平正常；VD3组维生素D水平：47.10±12.64 nmol/L，8例（42.1%）患儿维生素D水平正常。接受维生素D干预3月时，VD2组显著高于VD1组和VD3组；VD1组和VD3组比较，维生素D水平无显著性差异。<br>　　VD0组、VD1组、VD2组、VD3组在基线时SCORAD评分均值为：46.92±12.77、42.37±11.11、45.14±10.70、51.86 ±11.87，各组AD患儿疾病严重程度在基线时无差异（P=0.1232）。经过维生素D补充 1 月后，干预各组 AD 患儿疾病严重程度 SCORAD 评分分别为：30.91±8.582、33.03±8.183、37.28±8.745，与各组的基线 SCORAD相比均有显著下降。各组与未干预组患儿VD0组（35.72±6.49）相比， SCORAD值无显著差异（P=0.1129）。<br>　　在VD补充3月后，各组患儿SCORAD评分分别为：27.56±9.224、22.18±5.086、26.47±5.437与基线相比进一步下降；与VD0组（32.58 ±5.41）相比有差异（P＜0.0001）。VD2组以及VD3组与VD0组相比SCORAD均显著下降。<br>　　在VD补充 3 月后，接受 VD 补充患儿维生素 D 正常者（≥50nmol/L）和维生素D不足者（小于50nmol/L）疾病严重程度评分分别为：22.32±5.454、29.14±6.801，维生素D水平正常者疾病严重程度显著下降（P=0.0005）。同时，患儿体内维生素 D 水平升高程度与疾病严重程度SCORAD评分下降程度正相关（r=0.377，P=0.008）。<br>　　结论：补充维生素D治疗儿童AD是一种耐受性好、安全、有效的办法。补充时间不宜过短，3 月方能显示出 VD 保护作用。以每日2000IU的补充剂量，口服补充的方式效能最高。50nmol/L可作为AD患儿VD补充的目标。<br>　　第三部分 VD辅助治疗特应性皮炎的可能机制<br>　　背景：TLR-2、LL-37承担着皮肤屏障和固有免疫的双重作用，在皮肤防御和炎症中发挥重要作用。体外研究表明 TLR2 活化后依赖VD/VDR 途径诱导巨噬细胞表达抗菌肽 LL-37，从而直接杀灭细胞内结核杆菌。无论是既往的研究还是我们前一部分结果都表明维生素 D对特应性皮炎是有效的，然而目前关于补充 VD 治疗 AD 的机制研究很少。维生素D骨外效应提示其能通过基因、非基因方式调整机体固有免疫、获得性免疫，影响皮肤屏障结构蛋白的表达，而使其在特应性皮炎中发挥保护作用成为可能。因此基于上述研究背景提出假设：特应性皮炎中维生素D经由VD/VDR-TLR2-LL-37途径发挥保护作用。<br>　　目的：检测特应性皮炎患儿 VD 补充前后与皮肤屏障功能、固有免疫有关的TLR2、LL-37状态，进而探寻VD补充治疗特应性皮炎的可能机制。<br>　　方法：该部分包括两个小节内容：第一小节以2-12岁AD患者为研究对象。以Hanifin-Rajka标准纳入研究对象，以同时期性别年龄匹配的健康儿童为对照。Real-time PCR检测外周血白细胞VDR、TLR2以及LL-37表达情况；酶联免疫吸附法检测血清LL-37水平；其次VD小于50nmol/L的AD患儿，每日补充维生素D3 2000IU，3月后，比较该组患儿补充前后 VD 水平，SCORAD 评分、外周血白细胞 TLR2、LL-37 表达以及血清 LL-37 水平的差异。第二小节以永生角质形成HaCaT为研究对象。以TLR2受体激动剂—金葡菌肽聚糖（PGN-SA）刺激HaCaT细胞，分析TLR2、VDR、LL-37的表达情况。其次以VD预处理HaCaT细胞后，再以PGN-SA刺激，分析TLR2、VDR下游基因LL-37的表达情况。<br>　　结果：补充维生素D后，患儿VD水平显著升高，SCORAD显著下降。AD患儿与健康对照相比外周血白细胞表达的VDR、TLR2、LL-37均显著降低。白细胞表达LL-37 水平与VDR、TLR2正相关。白细胞表达LL-37水平与血清维生素D水平正相关。患儿血清LL-37水平显著低于健康对照，但与患儿维生素D水平以及SCORAD无相关。接受维生素D补充后，患儿TLR2、LL-37表达均显著上升，患儿血清LL-37也显著上升。<br>　　PGN-SA可刺激HaCaT细胞在24、48、72小时分别顺序表达TLR2、VDR，LL-37。VD预处理HaCaT细胞后，PGN-SA能诱导HaCaT细胞显著高表达TLR2、LL-37。<br>　　结论：特应性皮炎患儿口服补充VD 2000IU/天 ，连续3个月，有助于缓解特应性皮炎患儿病情。特应性皮炎患儿TLR2、LL-37表达，血清LL-37水平均低，提示AD存在固有免疫、皮肤屏障功能缺陷，可能是其容易继发细菌病毒感染的原因。维生素D可能通过活化VDR经由TLR2途径促进机体表达抗菌肽LL-37，改善机体固有免疫以及屏障功能方式，在AD中积极发挥保护作用。