检索历史 清除

摘要背景与目的:<br>　　乳腺癌是我国女性发病率最高的恶性肿瘤,随着早诊技术及规范性综合治疗策略的提高,乳腺癌的治疗有了很大的进步.然而,乳腺癌的复发、转移仍然是临床上的一大难题.肿瘤异质性被认为是乳腺癌复发、转移的重要因素.而肿瘤干细胞学说一直被认为是肿瘤异质性的重要原因之一.H3K27me3在前列腺癌、卵巢癌肿瘤干细胞的干性维持上起着重要的作用,而其在乳腺癌干细胞中的作用研究尚且匮乏.基于上述假说及研究成果,本研究小组猜想,H3K27me3是否在乳腺癌干细胞的干性维持中也起着一个重要的作用?随后,本研究小组围绕H3K27me3在乳腺癌干细胞的干性维持中的作用展开研究,探讨H3K27me3在不同分子分型乳腺癌细胞株及其干细胞中的含量水平差异,及其表观调控乳腺癌干细胞干性维持的具体机制.寻找一个能特异性清除乳腺癌干细胞的靶向制剂,对提高复发、转移性乳腺癌患者的生存率及其生存质量有很重要的意义.<br>　　方法:<br>　　1. 乳腺癌干细胞富集培养及鉴定<br>　　(1)采用无血清培养基诱导MDA-MB-231和MCF7乳腺癌干细胞富集微球形成.<br>　　(2)采用 Western blotting 和 RT-QPCR 方法分别从翻译及转录水平检测MDA-MB-231和MCF7微球中肿瘤干细胞标志物的表达情况.<br>　　2. H3K27me3在乳腺癌贴壁细胞及乳腺癌悬浮微球中的蛋白质水平差异<br>　　采用Western blotting方法检测H3K27me3在MCF7和MDA-MB-231贴壁细胞及其悬浮微球中的蛋白质水平差异.<br>　　3. H3K27me3在乳腺癌干细胞干性维持中的作用<br>　　(1)H3K27me3去甲基化抑制剂GSKJ4对乳腺癌贴壁细胞的增殖影响<br>　　利用CCK8细胞毒性实验检测经梯度浓度GSKJ4处理后的MDA-MB-231、MCF7贴壁细胞的细胞活性,筛选出最佳的给药浓度.<br>　　(2)H3K27me3对乳腺癌干细胞自我更新能力的影响<br>　　利用6uM和20uM GSKJ4分别处理MCF7、MDA-MB-231贴壁细胞72小时,同时设置对照组,随后,分别利用各组贴壁细胞进行克隆形成实验,14 天后,比较各样本对照组与实验组中克隆形成的集落数量的差异.<br>　　采用6uM和20uM GSKJ4分别处理已培养5天的MCF7、MDA-MB-231微球体72小时,同时设立对照组,随后统计比较实验组与对照组间微球体形成数量的差异.<br>　　(3)H3K27me3对乳腺癌贴壁细胞中乳腺癌干细胞亚群比例的影响<br>　　6uM和20uM GSKJ4分别处理MCF7、MDA-MB-231贴壁细胞72小时,同时设置对照组.接着,利用流式细胞检测技术分别检测实验组与对照组中MCF7、MDA-MB-231细胞株中CD44+CD24-和ALDH1+乳腺癌干细胞亚群比例的差异.<br>　　(4)H3K27me3对小鼠成瘤能力的影响<br>　　利用20uM GSKJ4处理MDA-MB-231贴壁细胞72小时,同时设置对照组,利用这两组细胞分别构建裸鼠成瘤模型,定期监测两组裸鼠成瘤的体积及重量的变化.<br>　　4. H3K27me3在乳腺癌干细胞中干性维持的作用机制<br>　　(1)利用Western blotting和RT-QPCR检测MCF7和MDA-MB-231贴壁细胞及悬浮细胞中JMJD3和UTX蛋白质及mRNA表达水平差异.<br>　　(2)利用Western blotting和RT-QPCR检测GSKJ4处理组及非处理组MCF7和MDA-MB-231贴壁细胞中Nanog、Sox2、Oct4、JMJD3和UTX蛋白质及mRNA表达水平差异<br>　　(3)利用siRNA瞬时转染技术沉默JMJD3和UTX的功能,siNC作为对照组,随后检测2组贴壁细胞中 JMJD3、UTX、Nanog、Sox2、Oct4 蛋白质与mRNA表达水平及H3K27me3蛋白质含量水平的差异.<br>　　结果:<br>　　1. 与乳腺癌贴壁细胞相比,H3K27me3 在乳腺癌悬浮微球中蛋白质含量更少.<br>　　2. GSKJ4可有效抑制乳腺癌细胞的增殖(P<0.05),且MDA-MB-231的IC50显著高于MCF7(P<0.05).<br>　　3. GSKJ4 可降低 MCF7、MDA-MB-231 乳腺癌贴壁细胞的克隆形成率(P<0.05)、乳腺癌干细胞亚群比例(P<0.05)及小鼠移植瘤的体积和重量(肿瘤重量P<0.05,肿瘤体积P<0.01).<br>　　4. 与乳腺癌贴壁细胞相比,UTX、JMJD3 在乳腺癌悬浮微球中蛋白质及mRNA(P<0.05)表达显著增高.<br>　　5. GSKJ4可降低MCF7、MDA-MB-231乳腺癌贴壁细胞中JMJD3(P<0.05)和UTX(P<0.01)蛋白质及mRNA表达水平,提高H3K27me3蛋白质含量水平.<br>　　6. 沉默JMJD3及UTX的功能后,MCF7、MDA-MB-231中H3K27me3蛋白质含量水平上升,JMJD3、UTX、Nanog、Sox2、Oct4蛋白质及mRNA表达水平显著下降(P<0.05).<br>　　结论:<br>　　1. H3K27me3可抑制乳腺癌干细胞的自我更新能力及干性维持作用.<br>　　2. H3K27me3去甲基化抑制剂GSKJ4,可通过抑制JMJD3和UTX去甲基化酶的活性从而影响乳腺癌干细胞的干性维持.<br>　　3. GSKJ4有望成为一个新型乳腺癌干细胞的靶向制剂.