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白血病抑制因子对退变椎间盘髓核细胞凋亡和胞外基质代谢的影响及机制研究

摘要研究背景:<br>  下腰痛(low back pain, LBP)因其高发病率、高致残率,以及由此付出的高额医疗花费,日益成为一个严重的公共健康问题。目前普遍认为椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是其主要的发病机制,而在IDD进程中尤以位于中央的髓核组织改变最为显著。髓核细胞(nucleus pulposus cells, NPCs)凋亡加剧,胞外基质(extracellular matrix, ECM)代谢失衡被认为是IDD的主要特征。减少NPCs凋亡,促进ECM合成代谢是治疗IDD的主要策略。白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor, LIF)是一种多功能细胞因子,作者前期已研究报道LIF对软骨细胞ECM基质代谢有着重要调控作用,而NPCs作为一种“类软骨细胞”,与软骨细胞表型相近,因此我们大胆提出如下科学假设:LIF同样对退变椎间盘NPCs的凋亡和ECM代谢调控扮演着重要角色。<br>  目的:<br>  以人退变NPCs和兔IDD模型为研究对象,探讨LIF对退变NPCs凋亡及ECM代谢的影响及其机制研究。<br>  方法:<br>  首先通过针刺法构建兔IDD模型,术后特定时间点行磁共振检测影像学评价IDD程度;并在对应时间点处死后摘取髓核组织,组织标本行番红O/固绿染色观察ECM表达情况,提取组织蛋白后western blot检测LIF蛋白表达。分离提取人退变NPCs,加入不同浓度重组人LIF蛋白(rhLIF 0 、10 、20 、 50 、100 ng/ml)后,分别行阿利新蓝染色、CCK-8检测及Annexin V-FITC/PI流式细胞术,初步探讨LIF对退变NPCs凋亡及ECM代谢的影响。<br>  为进一步探讨LIF调控ECM表达的机制,采用不同浓度rhLIF蛋白刺激不同时间后,western blot检测ECM主要成分II型胶原(COL2)和聚蛋白多糖(AGCAN),同时检测关键ECM代谢酶MMP-3和TIMP-1表达。此外,还检测了Akt和MAPK信号通路,为进一步验证ERK1/2通路对ECM表达的影响,加入其特异性抑制剂PD98059后再行COL2和AGCAN蛋白表达检测。最后采用直接椎间盘穿刺注射的方式分别将rhLIF,或rhLIF+PD98059注入兔IDD动物模型体内,观察其对延缓IDD的实际疗效。<br>  结果:<br>  针刺法成功构建兔IDD模型后,检测发现随着时间推移磁共振显示其椎间盘含水量逐渐下降;同时番红O/固绿染色结果显示其ECM加剧降解,western blot结果提示LIF表达随着退变加剧,表达升高。体外细胞学实验提示加入rhLIF后,退变NPCs的ECM合成增多,细胞活力增强,同时减少了细胞凋亡。初步提示LIF对退变NPCs的ECM合成及凋亡具有重要调控作用。进一步行机制探讨发现,rhLIF可以显著上调ECM主要成分COL2和AGCAN表达,同时抑制MMP-3、提高TIMP-1表达,提示对ECM代谢酶有着重要影响。信号通路检测结果表明, rhLIF可以激活ERK1/2通路,而加入PD98059后,western blot结果提示COL2和Aggrecan蛋白表达明显下调。最后兔IDD模型体内实验表明,rhLIF可以切实延缓体内椎间盘退变进程,但加入PD98059后上述治疗效果被大大削弱。<br>  结论:<br>  LIF在退变髓核细胞中高表达,可以抑制NPCs凋亡、促进ECM合成,其促进ECM合成与ERK1/2信号通路的激活有关。本研究有望为今后寻找治疗IDD的新靶点提供参考。

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