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摘要背景<br>　　结直肠癌（CRC）是全世界范围内癌症相关死亡率的主要来源之一。大约50%的治疗病例在首次诊断后5年内复发并导致死亡[1] 。早期发现CRC为预防CRC死亡提供了最好的机会:对于转移的CRC患者，手术切除局部肿瘤后的5年生存率为90%，显著降低至10%[2, 3]。尽管目前广泛使用的大肠癌筛查技术、乙状结肠镜检查和结肠镜检查等可以减少CRC患者的死亡率，但是接受检查的患者数量仍然有限，部分是因为侵入性检查以及对检查的带来的不适感的恐惧[4-8]. 因此，寻找新的生物标志物作为非侵入性分子检测的靶点，有助于将CRC筛查引入临床分析的常规程序。蛋白质生物标志物非常适合基于血液和粪便分析的新型体外分子检测的发展。目前，癌胚抗原(CEA)[9]和粪血红蛋白(f-Hb)是唯一被批准用于CRC临床的可溶性蛋白生物标志物。然而，CEA也可能在健康、重度吸烟者对炎症条件的反应、I型和II型糖尿病、溃疡性结肠炎、胰腺炎和肝硬化中过度表达[10] 。因此，CEA试验可用于监测CRC的进展，因此可作为预后标志物[11,12-14]，但这并不是早期检测CRC的可靠方法[15-17]。CRC最常用的筛查方式是愈创木脂化学法粪便潜血检测(gFOBT)。不幸的是，这项检测并不能检测出大多数息肉和癌症，需要多种粪便样本才能很好地解释结果。另外，gFOBT容易出现假阳性结果，这是正常良性环境的结果，如摄入某些食物和消炎药。目前正在进行广泛的研究，以寻找有用的生物标志物，改善目前CRC筛查的诊断手段，并可用于预测治疗结果，发现非侵入性早期检测方法的新工具是一个优先事项。<br>　　美国国家癌症研究所(National Cancer Institute, USA)将生物标志物或特征分子定义为血液、其他体液或组织中可客观测量的任何生物分子，可作为正常/异常生物过程或病理状态的指标。生物标志物可以揭示疾病，预测预后或预测药物或治疗干预的反应[18]。通常，一个给定的生物标志物要在临床实践中使用必须具有延长预期寿命或提高生活质量的作用。根据使用它们的目的，我们可以区分三种主要类型的生物标志物:诊断、预后和预测。任何可检测到的癌细胞在DNA、RNA、蛋白质或代谢物水平上的分子变异都可以被视为“癌症生物标志物”[19]。癌症是由于基因突变的积累导致细胞过程的改变，如血管生成、增殖、凋亡和衰老[20,21]。因此，最初使用基因组学和转录组学方法寻找标记物[22,23]，这些方法详细阐述了癌症的遗传基础。通过选择性剪接mRNA并结合大量翻译后修饰，一个基因可以编码多种蛋白[24]。平均而言，一个给定的基因可以编码4个具有不同序列和活性的选择性剪接变异体[24]。蛋白质组比基因组更有动态性;因此，它更准确地反映了细胞的机制。通过蛋白质组学，可以分析成千上万的癌细胞蛋白，从而为CRC产生新的治疗靶点和标志物。在这种背景下，蛋白质组学是一种理想的、高度可翻译的研究工具，可用于发现新的癌症生物标志物。蛋白质组学方法已被广泛应用于寻找新的CRC生物标志物，并阐明CRC的分子机制；这导致了许多蛋白质的鉴定，这些蛋白质有可能被用作解决临床需要的生物标志物，采用蛋白质组学方法对不同来源的各种样品进行了分析。<br>　　如何在不违背伦理学的前提下，有效获取并保存人体肿瘤资源并用于科学研究，是尚未妥善解决的问题。低温冻存被公认为是组织与器官长期保存的最有效方法之一，其原理是通过降低细胞代谢率保护组织细胞以及细胞组分。但是，由于新鲜标本保存成本较高且复杂，难以在大多数地市级医院病理科开展，及时保存肿瘤组织是病理医师和临床医师开展临床科研工作的基础。<br>　　福尔马林固定石蜡包埋( Formalin Fixed Paraffin Embedded，FFPE) 是病理科普遍采用的组织处理和保存方法；组织标本经取材、固定、脱水、透明、浸蜡以及包埋等程序处理之后可长时间保存；与新鲜标本不同的是，FFPE组织操作流程简单，易于掌握，可以实现高度自动化处理，而且代价低廉，适合大多数医院病理科开展。因此，FFPE组织已广泛应用于病理科的常规病理临床工作中。与新鲜冰冻组织以及OCT组织相比，尽管FFPE组织具有这么多优势，但是其作为科研的样本劣势也非常明显，其中共价交联、低蛋白溶解率以及低肽段回收率就是目前研究人员难以突破的瓶颈。如何尽早突破该瓶颈显得特别重要。<br>　　第一部分 结肠癌FFPE组织多种蛋白提取缓冲液蛋白提取效率的比较以及蛋白定量方法<br>　　目的：为了优化临床FFPE组织蛋白的提取效率，进一步为蛋白组学研究质谱分析提供较好的样本，在目前尚缺乏可靠、可重复的FFPE蛋白组学标准样品制备方法的条件下，我们拟寻求一种高效稳健的FFPE组织蛋白提取方法。<br>　　方法：基于成本、易用性以及是否适用于质谱分析，选取多种含有一定浓度的非离子、离子去污剂（十二烷基硫酸钠，SDS）和还原剂（二硫苏糖醇，DTT）的蛋白提取缓冲液。这些缓冲液成份经过一定的改良，使组织的溶解度升高，同时，蛋白裂解过程中通过高温孵育以及超声波碎裂等方法以期最大程度地打开共价键交联。蛋白提取后，采用BCA蛋白定量分析方法以及SDS-PAGE方法检测所提取蛋白的相对浓度，以备下一步使用。<br>　　结果：我们比较了3种含有不同浓度的非离子、离子去污剂SDS和还原剂DTT的蛋白提取缓冲液对结肠癌FFPE组织的蛋白提取效率，BCA检测结果以及SDS-PAGE结果表明含有2%SDS的缓冲液较SDS浓度相对较低的缓冲液具有较高的提取效率。<br>　　结论：我们通过优化和改良了FFPE组织蛋白提取缓冲液的组成成份和蛋白提取流程，成功从FFPE组织中获得较高浓度的蛋白溶液，并且发现含有相对更高的去污剂SDS的缓冲液具有更高的蛋白提取效率。<br>　　第二部分 结肠癌FFPE组织溶液内消化，凝胶内消化以及悬浮S-Trap肽段回收效率的比较<br>　　目的：自下而上的蛋白质组学策略依赖于有效地将蛋白质消化成肽段进行质谱分析，本研究将探索一种新的、强劲的FFPE组织蛋白消化方法以便从临床FFPE组织中获取可供质谱分析的组织全蛋白组。<br>　　方法：溶液内消化以及凝胶内消化已经常规用于新鲜冰冻组织以及OCT组织的蛋白消化中，对于FFPE组织，因为化学交联和常规蛋白裂解缓冲液的低溶解度以及所提取的蛋白含有高浓度的SDS等原因，目前尚无可靠稳健的蛋白消化方法。尽管近年来流行的去污剂去除和消化方法是过滤器辅助样品制备法(FASP)，可以一定程度去除SDS等去污剂，但是去实验方案的繁杂性以及实验结果的不稳定性常常阻碍其在高通量蛋白质组学研究中的应用。基于这些原因，我们开发了新的技术来辅助基于SDS的蛋白质组样本的准备。<br>　　我们通过第一章描述的FFPE蛋白提取方法中提取结肠癌FFPE组织蛋白后，分别以溶液内消化、凝胶内消化以及新近报道的S-Trap消化方法对蛋白样品进行消化以寻求最有效的液相色谱质谱分析样品准备方法。每种消化方法，我们使用相同的8个原发性结肠腺癌的临床FFPE样本，每一个样本蛋白含量为100?g，所有样品用胰蛋白酶和赖氨酸-C混合酶双重消化。因为含有样本中含有高浓度的去污剂SDS，SDS与质谱分析仪不兼容，故在溶液内消化C18脱盐步骤前，采用Pierce去污剂旋转柱试剂盒去除残留的SDS，凝胶内消化以及S-Trap消化方法不需要去除去污剂以及C18脱盐。蛋白消化成肽段后用Pierce定量比色法以及Q-Exactive质谱仪测定每个样本肽段的含量，比较三种方法的平均肽段回收率。<br>　　结果：Pierce定量比色法测定肽段的含量结果提示在溶液内消化、凝胶内消化以及S-Trap消化方法平均肽段恢复率分别是9.1%, 9.5% 和93.5%。Q-Exactive质谱分析结果显示溶液内消化方法所得的蛋白、肽段以及谱系的数量分别是：443、1126和1423；凝胶内消化方法所得的蛋白、肽段以及谱系的数量分别是：418、1211和1229；S-Trap消化方法所得的蛋白、肽段以及谱系的数量分别是：1855、9433和11311。<br>　　结论：与传统的溶液内和凝胶内消化方法相比，新的S-Trap消化方法在FFPE样品中肽段回收率明显高于其它两种方法。S-Trap操作方法简单，允许溶液内含有较高浓度的去污剂SDS，肽段回收率高，为深入蛋白组学研究提供较好的质谱样本。<br>　　第三部分 基于液相色谱质谱联用的蛋白组学结肠癌FFPE组织差异蛋白的检测及肝转移过程的认识<br>　　目的：本研究将利用超高分辨率傅里叶变换质谱技术对FFPE库存样品进行深入蛋白质组分析，为FFPE开发一种稳健的深入蛋白质组分析方法，并将其应用于原发性和匹配转移性结肠癌的蛋白质组差异表达蛋白的检测并了解肿瘤转移过程。<br>　　方法：我们选择了18个结肠腺癌病人共58个匹配有正常组织、原发性肿瘤组织和肝转移组织的样本，其中正常组织样本18个、原发性肿瘤组织21个和肝转移瘤组织19个。所有样本均取自美国纪念斯隆凯特琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center, MSKCC）生物样本库。蛋白提取方法见本文第2章结肠癌FFPE组织多种蛋白提取缓冲液蛋白提取效率的比较以及蛋白定量方法部分，蛋白提取缓冲液为含有2%SDS的缓冲液1。质控样本从所有的58个样本的蛋白提取物中获取。蛋白质消化方法选用S-Trap法，消化酶选用胰蛋白酶/赖氨酸混合酶，详细方法见第3章S-Trap消化样本准备方法。非标记定量（LFQ）方法行液相色谱质谱联用的质谱分析（LC-MS/MS），质谱分析仪是最新一代的傅立叶变换Orbitrap Fusion Lumos高分辨质谱仪；MaxQuant进行数据库搜索匹配蛋白质，统计学分析使用Perseus软件，GO功能注释和KEGG通路分析使用DAVID等相关数据库工具。<br>　　结果：58个结肠癌FFPE样本，共检测出6052种蛋白质，这些蛋白质中有3200种共同存在于正常组织、原发肿瘤组织和肝转移组织中，而373种、923种和764种蛋白在正常组织、原发性肿瘤组织和肝转移组织所特有。<br>　　GO功能注释能发现原发肿瘤与转移肿瘤等共有的蛋白质，更能发现转移组织特有的蛋白质。同样，KEGG信号通路分析能发现肿瘤组织中所含有各种特异性的信号通路。<br>　　转移样本的无监督聚类分析检测到了590个差异表达蛋白，这些蛋白被70%或更多的结肠癌样本所共享。在转移灶中发现三个表达明显的聚类，聚类1集中有188个蛋白，聚类2集中有118个蛋白，聚类3集中有284个蛋白。药物与基因相互作用数据库（DGIdb）进一步分析表明，聚类1匹配有FDA批准的137种转移特异性的药物治疗靶点的66种上调蛋白，聚类2匹配有FDA批准的230种转移特异性的药物治疗靶点的54种上调蛋白，聚类3匹配有FDA批准的148种转移特异性的药物治疗靶点的42种上调蛋白。<br>　　结论：将深入蛋白质组分析应用于原发性和肝转移性结肠癌的同步组，揭示了转移中的新的特异性信号通路和簇聚类。这些结果加深了我们对癌症转移生物学性质的理解，并可能导致新的药物靶点和预后标志物。