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脂肪干细胞的分离提取及诱导分化为雪旺样细胞的特性研究

摘要目的:探讨经Ⅰ型胶原酶消化法提取的SD大鼠原代脂肪干细胞(ADSCs),诱导分化为雪旺样细胞(dADSCs),比较ADSCs分化前后细胞形态、染色特性及细胞表面特征分子、嘌呤受体P2X7,髓鞘蛋白P0和神经营养因子及相应受体的表达变化,从而观察 ADSCs 是否具有向雪旺细胞(SCs)的分化潜能并具有修复神经损伤的必要的物质,为临床ADSCs用于修复神经损伤提供实验依据。<br>  方法:雄性SD大鼠,体重300±10g,无菌条件下解剖取大鼠腹股沟处脂肪组织,经Ⅰ型胶原酶消化后离心,200目细胞筛过滤,接种培养。通过差速贴壁法纯化细胞,传至第3代后开始用于实验。MTT法检测第3代、第5代、第7代、第9代和第13代细胞活性。选用第3代ADSCs细胞用于实验。流式细胞术检测ADSCs表面特征分子CD29,CD44,CD45和CD90,根据其阳性表达率鉴定ADSCs特性。uADSCs以2×105/mL的密度铺六孔板,用1mM β-巯基乙醇处理24 h,35 ng/mL全反式维甲酸处理72 h,5 ng/mLPDGF、10 ng/mLbFGF、14 uM forskolin、200ng/mLheregulin诱导分化1周,油红O染色观察分化前后细胞的形态变化。使用uADSCs和dADSCs提取蛋白,BCA法蛋白定量,通过蛋白免疫印迹法检测嘌呤受体P2X7,神经营养因子NT-3、NRG-1,神经经营养因子受体TrkC,ErbB-4和髓鞘蛋白P0蛋白的含量表达变化。<br>  结果:原代培养 ADSCs贴壁速度较快,24 h后细胞由圆形伸出伪足,48 h后细胞为短梭形,星形和多角形,形状不规则。传代后细胞多为梭形结构。MTT检测数据分析,复苏后的细胞生长活性没有明显区别,第3代的细胞活性比第5代的活性较好。流式细胞术检测ADSCs结果显示CD45为阴性表达,CD29,CD44和CD90表达为阳性。油红O染色发现uADSCs红染而dADSCs无红染,说明uADSCs向dADSC分化后,脂肪特性下降。蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测结果显示uADSCs和dADSCs都可表达P2X7蛋白,表达量无显著差异。神经营养因子 NT-3、NRG-1、神经营养因子受体 TrkC、ErbB-4、髓鞘蛋白 P0 在uADSCs和dADSCs中都有表达,其中dADSCs的NT-3、NRG-1、TrKC、ErbB-4的表达量显著高于 uADSCs 组(P<0.05),而 P0 的表达量在二组之间无显著性差异,说明ADSCs分化后合成神经营养因子功能增强,或许为ADSCs促进神经修复生长的主要机制。<br>  结论:大鼠原代培养ADSCs诱导分化为雪旺样细胞后,脂肪性下降,神经营养因子及对应受体表达量增加,嘌呤受体P2X7、髓鞘蛋白P0无明显变化,说明ADSCs分化后促进神经修复的主要机制与神经营养因子合成增加有关。

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发布时间 2019-11-25(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)
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