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摘要DNA甲基化是表观遗传最基本的修饰方式，其修饰的分子本质是在胞嘧啶（Cytosine，C）的第五个碳原子上添加甲基CH3，形成5甲基胞嘧啶（5-methyl Cytosine，5-mC）而不改变DNA序列。由于DNA甲基化对细胞分化、胚胎发育和肿瘤发生等基因表达、基因印记和基因沉默的调控作用，DNA甲基化已成为继限制性片断多态性、DNA点突变之后最具价值的第三代遗传标记。DNA甲基化是肿瘤发生中抑癌基因失活和癌基因活化的重要机制，国内外研究证明抑癌基因高甲基化和癌基因低甲基化是肿瘤形成的早期特征性改变；且发现多发性硬化症、地中海贫血等遗传性疾病，和包括系统性红斑狼疮、I型糖尿病等在内的自身免疫性疾病特征性的靶基因甲基化偏倚。DNA甲基化失衡，已成为肿瘤等基因表观遗传紊乱类疾病早期诊断与预警的新靶点。因此，定量分析特定序列DNA甲基化水平，已成为表观遗传研究、自身免疫性疾病和肿瘤等基因表观紊乱疾病早期诊断与预警，和肿瘤等去甲基化治疗方案选择的新手段，DNA甲基化定量分析临床适宜检测技术研究已成为实验诊断医学与表观遗传学交叉研究的前沿领域。<br>　　电化学生物传感器是通过将分析体系中识别分子与靶分子的相互作用转化为电响应信号而实施检测的一类分析技术，具有操作便捷、结果判读直接、易于临床实验室推广等优点，已广泛应用于生物分析检测。近年来，为了进一步提高传感器分析性能，各种功能化纳米材料被开发并用于电化学生物传感器的构建。其中，DNA纳米材料因其具有结构稳定、编码性强、制备简单和生物相容性好等优点，在电化学生物传感分析方面具有重要的应用前景。鉴于此，本文主要利用DNA功能化纳米材料和G-四链体/hemin模拟酶生物辅助信号放大技术，构建生物传感器并用于甲基化 DNA 的定量分析。主要研究内容及结果如下：<br>　　1.基于DNA四面体及RCA扩增的电化学传感技术并用于5-mC检测<br>　　本实验利用三条巯基修饰的单链DNA与特定DNA序列合成DNA四面体，通过Au-S键将DNA四面体固定在金电极表面，实现传感界面探针的高效固定。重亚硫酸氢盐同时处理含有5-mC目标序列和不含5-mC的核酸序列后，仅含有5-mC目标序列与线性锁式探针发生环化反应。以环化后的核酸序列为模板，DNA四面体顶点延伸的单链DNA探针为引物引发RCA扩增反应，生成一条富含G碱基的DNA长链，与氯化血红素（hemin)结合后，形成G-四链体/hemin DNAzyme模拟酶，该酶具有辣根过氧化物酶活性，在H2O2存在下催化放大亚甲基蓝（methylene blue，MB）产生的电流响应信号。在最优实验条件下，该电化学生物传感器DPV电流信号与5-mC目标序列浓度的对数呈现良好的线性相关性，线性范围为10-15 M到10-8 M，检测限为0.1 fM。该电化学生物传感器具有灵敏度高、选择性好、制备简单等优点，并成功应用于甲基化DNA回收实验检测。<br>　　2. 基于 CdS@DNA S1 和 PTB7 的光致电化学生物传感器及其在5-mC 检测中的应用<br>　　为实现低丰度DNA甲基化的定量分析，在本研究中，我们首次采用硫化镉量子点（CdS QDs）结合[[4,8-双[(2-乙基己基)氧基]苯并[1,2-b：4,5-b']二噻吩-2,6-二基] [3-氟-2-[(2-乙基己基)羰基]噻吩并[3,4-b]噻吩二基]]（PTB7）作为光活性材料构建光电化学（photoelectrochemical，PEC）生物传感器检测并用于DNA甲基化检测。首先CdS QDs标记的信号探针C d S@D N A S 1 与金纳米粒子（AuNPs）和第二抗体（ anti-IgG ）复合物上 anti-IgG/AuNPs 的 DNA S0序列杂交，形成anti-IgG/AuNPs-C d S@D N A S 1 纳米复合物。当甲基化DNA存在时，抗5甲基胞嘧啶抗体与5-mC特异性识别，随后5-mC抗体与IgG结合，因为CdS QDs增加了电极的空间位阻并抑制电子从抗坏血酸电解质向PTB7转移，从而降低电极表面PTB7的光电流信号，且降低的光电流信号与DNA甲基化的浓度呈正相关性。在最优实验检测条件下，所构建的PEC传感器的光电流响应信号与5-mC目标序列浓度的对数呈现线性相关性，线性范围为500 pM到50 aM，检测限为50 aM。本实验提供了一种基于CdS QDs和PTB7的PEC分析方法，该方法可以显著提高光电转换效率，并为建立低背景、高灵敏的低丰度甲基化DNA定量分析提供新思路。