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摘要【背景】<br>　　肾脑表达蛋白（kidney and brain expressed protein，Kibra）由WW结构域蛋白1（WWC1，WW domain-containing protein 1）基因编码，在肾脏和脑内记忆相关区域特异性表达。Kibra是一种调节学习记忆的突触支架蛋白，全基因组相关性研究提示其多态性位点和记忆认知功能有相关性。WWC1 的遗传变异与多种神经系统疾病相关，如Tourette综合征（Tourette syndrome，TS）和阿尔兹海默症等。此外，缺乏Kibra的小鼠突触后α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate receptor，AMPAR）减少，并存在突触可塑性和学习记忆受损的情况。这说明Kibra可能通过调控AMPA受体参与学习记忆，但是具体作用机制仍不清楚。<br>　　Kibra具有串联WW12结构域，这是典型的I类WW域，可以与PPxY基序（即PY基序，P为脯氨酸，x为任何氨基酸，Y为酪氨酸）结合。WW结构域是一种广泛存在的蛋白质结构域，含有WW 域的蛋白质及其复合物参与到多种信号级联，如神经突触信号传导、Hippo肿瘤抑制通路、裂隙隔膜形成与维持等等。Dendrin 在中枢神经系统的分布主要位于海马 CA1 区锥体细胞的树突中。Kibra的WW结构域可以与Dendrin的PPxY基序特异性结合，并使Dendrin定位于胞质和核周。WW域介导的蛋白质相互作用通常较弱，而且Kibra与Dendrin的结合在大脑中的功能还没有研究，那么Kibra与Dendrin的结合是否也很弱？Kibra与Dendrin的结合是否具有生物学功能？Kibra是否通过与Dendrin的结合参与学习记忆过程？这些问题目前均不清楚。<br>　　【目的】<br>　　探究Kibra与Dendrin结合的结构特性，解释二者结合的特异性。合成阻断Kibra与Dendrin结合的多肽，研究Kibra与Dendrin的结合参与到学习记忆中的机制。探究Tourette综合征中Kibra突变诱导学习记忆受损的机制，为Tourette综合征防治提供理论支持。<br>　　【方法】<br>　　通过等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry analysis，ITC）分析Kibra的WW12结构域与Dendrin 的PY23CT结构域或者PY23衍生肽的亲和力。使用分析超速离心技术（analytical ultracentrifugation，AUC）和体积排除色谱法（size-exclusion chromatography，SEC）对Kibra WW12和Dendrin PY23CT及其复合物进行化学计量。通过X射线晶体学重构WW12/PY23CT复合物的高分辨率结构，分析复合物内氨基酸残基之间的相互作用。通过核磁共振技术研究WW12结合PY23CT前后的折叠情况，以及PY23CT和WW12的相互作用。利用穿膜肽介导多肽阻断原代神经元中Kibra和Dendrin的结合，利用腺相关病毒（AAV-CAG-PB-GFP等）阻断成年小鼠中Kibra和Dendrin的结合，通过免疫荧光染色分析破坏复合物的形成对于CA1锥体神经元及海马原代神经元树突棘数目的影响，利用Western Blot检测阻断Kibra与Dendrin结合后突触相关蛋白的表达情况。使用全细胞膜片钳电生理技术记录阻断 Kibra 和Dendrin 结合后小鼠海马 CA1 锥体神经元的电生理特征，使用微电极矩阵MED64记录CA3-CA1的长时程增强作用（long-term potentiation，LTP）。旷场实验、高架十字迷宫、转棒仪实验检测小鼠的焦虑抑郁情感状况与运动能力。Morris水迷宫检测小鼠的空间学习记忆能力。<br>　　【结果】<br>　　Kibra WW12与Dendrin PY23CT以超高亲和力结合。等温滴定量热法分别检测Kibra WW12与Dendrin PY123CT、Dendrin PY23CT、Dendrin PY1的结合，发现Dendrin PY123CT与Kibra WW12的亲和力中等（ITC未能拟合出结合常数Kd），PY1与Kibra WW12结合的亲和力很弱（Kd=16.5±0.9uM），而PY23CT与Kibra WW12之间有非常高的亲和力（Kd=4.8±0.3nM）。<br>　　Dendrin的 PY23CT结构域促进 Kibra 的 WW12串联结构折叠。利用核磁共振分别检测 15N-WW12/PY23CT、15N-WW12 的 1H-15N 异核单量子相干谱（heteronuclear single quantum coherence spectrum，HSQC），对比发现，未与Dendrin结合的 15N-WW12 的 1H-15N HSQC 谱分布是不均匀的，谱线展宽较与PY23CT 结合的 15N-WW12 窄。再进一步分析 15N-WW1、15N-WW2 的 1H-15NHSQC谱发现WW1折叠良好而WW2折叠程度低。与单个WW1相比，WW12 1H-15N HSQC谱中主链酰胺峰的谱线展宽减少，并存在微小位移。<br>　　Kibra WW12/Dendrin PY23CT以1:1比例结合。通过分析超速离心技术进行不同浓度的沉降平衡实验，均得到 WW12/PY23CT 结合物的分子量大小均为32.0±1.8kDa，WW12与PY23CT以1:1结合；体积排除色谱法也得到了同样的结果，WW12理论分子量为13.8kDa，测量分子量为13.9kDa；PY23CT理论分子量为18.5kDa，测量分子量为18.3kDa；1:1的WW12/PY23CT复合物理论分子量为32.2kDa，测量出的WW12/PY23CT分子量为31.9kDa。但是X射线晶体学结果提示WW12和PY23CT以2:2比例形成四聚体，WW12 C端的加长螺旋结构α2（氨基酸残基85-127位）形成了平行的卷曲螺旋。通过 1H-15N异核NOE实验发现，第93位以前的残基NOE值大于0.5，到残基Q93以后＜0.5，α2的加长螺旋二聚体是晶体堆积产生的伪影。根据此结果得到Kibra WW12与Dendrin PY23CT以1:1形成异二聚体，并构建出异二聚体的结构。<br>　　Kibra的α2螺旋与WW12域间连接体促进与Dendrin PY23CT的结合。根据X射线晶体学重构出的WW12和PY23CT复合物的高分辨率结构，我们发现复合物中WW1和WW2域间连接体与C端α2螺旋存在许多疏水作用、电荷相互作用和氢键相互作用。替换氨基酸或者删减α2螺旋破坏了这些作用，而且ITC实验证实了替换氨基酸或者删减 α2 螺旋时结合力降低。用带正电荷的精氨酸（Arg）替换不带电荷的缬氨酸V228，使Arg与天冬氨酸D17、D19之间引入电荷相互作用，再用脯氨酸（Pro）替换丙氨酸A229。ITC检测出VA-RP突变进一步增强了PY23CT突变体与WW12的结合力。<br>　　Dendrin的PY模体间残基决定于Kibra结合的特异性。ITC检测发现具有WW12类似结构域的蛋白质与Dendrin PY23CT的结合很弱。Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）的WW12与DendrinPY23CT结合的Kd为400 nM，比起Kibra WW12弱80倍。痒同源物E3泛素蛋白连接酶（Itchy E3 ubiquitin protein ligase，ITCH）的WW12和WW34与Dendrin PY23CT的结合更弱。合成五种Dendrin PY23衍生肽，ITC以及15N-HSQC谱检测这些肽与Kibra WW12的结合，发现PY模体由两个丙氨酸连接时亲和力最强。而具有较长连接体的肽不能诱导 WW12 超模块形成，仅有一个丙氨酸连接的肽几乎没有检测到与 Kibra 的结合，说明Dendrin特异的PY23CT结构促使了与Kibra特异性的强结合。<br>　　阻断 Kibra 与 Dendrin 的结合导致使兴奋性突触传递受损。合成 PY23CT肽（PB肽）可以在不影响Kibra和Dendrin其他功能的前提下阻断二者的结合。PB肽处理神经元后，胞膜上谷氨酸受体1（glutamate receptor 1，GluR1）、谷氨酸受体2（glutamate receptor 1，GluR2）表达降低，树突棘数量减少。在成年小鼠海马CA1注射AAV-CAG-PB-GFP（AAV-CAG-PC-GFP、AAV-CAG-GFP为对照）抑制二者结合后，CA1 区锥体神经元树突棘数量减少，AMPA 受体表达降低。表达PB-GFP神经元的微小兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic currents，mEPSCs）和兴奋性突触后电流（excitatory postsynaptic currents，EPSCs）的幅度显著降低，但微小抑制性突触后电流（miniature inhibitory postsynaptic currents，mIPSCs）没有差异。而mEPSCs和mIPSCs的频率均无变化。说明阻断Kibra与Dendrin的结合导致兴奋性突触传递受损，而抑制性突触传递不受影响。<br>　　阻断Kibra与Dendrin的结合损害学习记忆。成年小鼠CA1注射AAV-CAG-PB-GFP 三周后，对CA1神经元传入纤维Schaffer侧枝给予短暂高频刺激，记录发现表达PB-GFP神经元场兴奋性突触电位（field excitatory synaptic potentials， fEPSPs）增强维持时间更短，15分钟内就减退到基础水平。而对照组给予强直刺激使CA1神经元fEPSPs平均振幅增加，持续60分钟以上。Morris水迷宫试验中，注射AAV-CAG-PB-GFP的小鼠到达平台的潜伏期更久，游泳路径也增长，且对目标象限的探索时间明显减少。<br>　　抑制Dendrin损害突触传递和学习记忆。抑制Dendrin表达的小干扰RNA-siDDN在小鼠海马表达三周后，检测AMPA受体、N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）等表达情况，发现胞膜中GluR1、GluR2表达显著降低，NR2A、NR2B、PSD95则无改变。分析成年小鼠海马CA1锥体神经元的mEPSCs和mIPSCs，发现表达siDDN的神经元mEPSCs幅度显著降低，mIPSCs的幅度、频率以及mEPSC频率均无差异。对CA1神经元传入纤维Schaffer侧枝给予一个短暂高频强直性刺激，CA1神经元fEPSPs平均振幅增加，持续60分钟以上。但是同样的刺激对表达siDDN神经元fEPSPs增强维持时间更短，15分钟内就减退到基础水平。用Morris水迷宫来检测表达siDDN对小鼠空间学习记忆能力的影响，发现 siDDN 组小鼠到达平台的潜伏期更久，游泳路径也增长，对目标象限的探索时间明显减少。<br>　　Kibra W88C突变破坏Kibra与Dendrin的结合。比较Kibra WW12WT（野生型）/PY23CT、Kibra WW12W88C（突变体）/PY23CT的1H-15N-HSQC谱，发现两者大体相似，突变体WW12仍然折叠，两个WW域基本完整。但是与野生型蛋白相比，pH=6.5时，W88C突变导致α2残基对应的酰胺峰消失，出现一组新的不规则卷曲结构。pH 升高到 8.0 时，新出现的峰消失。将不含二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）的柱缓冲液纯化得到的WW12WT和WW12W88C进行非还原性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，WW12WT主带在约14kD大小处。此外，约 30kD 处还有一条带，经 β-巯基乙醇的还原处理后消失。WW12W88C仅有一条带约14kD大小处，不存在二聚体带。Ellman试验发现纯化的WW12WT只有很少部分的半胱氨酸是氧化形式，但纯化的WW12W88C中96%的半胱氨酸都是氧化形式。<br>　　【结论】<br>　　Kibra与Dendrin以超高亲和力特异结合。除了串联WW域和PY模体的相互作用之外，Kibra WW12CT中WW12域间连接体和α2螺旋、连接PY模体的两个氨基酸残基、PY 模体后续的 CT 端都参与到 Kibra/Dendrin 特异结合中。Kbira 结合 Dendrin 通过调控 AMPA 受体的突触膜转运参与突触传递和学习记忆。Kibra W88C突变破坏Kibra和Dendrin的结合。该研究阐明了Kibra调控学习记忆的具体机制并为 Tourette 综合征和阿尔兹海默症中学习记忆障碍的干预治疗提供了线索。