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摘要目的：多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs)具有优越的电学、力学、热学和光学性能，使其成为各种工业和消费产品的首选材料，被广泛应用于电子工程、计算机科学、生物医学和航空航天工业等领域。尽管目前缺乏流行病学证据，但已有动物实验结果证实MWCNTs经呼吸道途径暴露可在大鼠和小鼠体内诱导肺纤维化。因此MWCNTs暴露也给人体带来肺纤维化疾病的潜在风险。Sirtuin 6（SIRT6）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadenine dinucleotide，NAD+）依赖性组蛋白去乙酰化酶，属于sirtuin家族成员。以往研究表明SIRT6可抑制肝脏、肾脏和心肌组织中纤维化的发生。然而，SIRT6在MWCNTs诱导的肺纤维化中的作用尚无报道。已知上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是促进肺纤维化发展的关键过程之一。本研究以人支气管上皮细胞BEAS-2B为对象，研究SIRT6在MWCNTs诱导的BEAS-2B细胞EMT中的作用及其对MWCNTs激活的TGF-β/Smads信号通路的影响，为寻找MWCNTs致肺纤维化有效的治疗靶点提供科学依据。<br>　　方法：通过透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）和扫描电子显微镜（scanning electronmicroscope，SEM）观测MWCNTs的微观结构和形貌；利用比表面积分析仪（Brunauer-Emmett-Teller，BET）测量MWCNTs的比表面积；通过热重分析（thermogravimetric analysis，TGA）测量MWCNTs的纯度；采用X射线衍射仪(X-ray diffraction，XRD)分析MWCNTs的物相组成。通过动态光散射法（dynamic light scattering，DLS）检测MWCNTs在培养基中的分散状态和稳定性。通过TEM观察MWCNTs是否能进入BEAS-2B细胞。通过CCK-8细胞活性检测试剂盒检测不同浓度（0.25μg/cm2、1μg/cm2、4μg/cm2和16μg/cm2）的MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h后的细胞活性，以确定MWCNTs染毒剂量。通过Western blot检测不同浓度（0.25μg/cm2、1μg/cm2和4μg/cm2）的MWCNTs处理 BEAS-2B 细胞 72 h 后内源性 SIRT6、上皮标志物 E-cadherin、间质标志物vimentin 和 α-SMA 蛋白表达水平。使用 SIRT6 的腺病毒过表达载体或 SIRT6 的shRNA腺病毒载体转染BEAS-2B细胞，过表达或敲低SIRT6，腺病毒转染24 h后用4μg/cm2 MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h，采用Western blot检测E-cadherin、vimentin、α-SMA和SIRT6的蛋白表达水平。使用SIRT6的腺病毒过表达载体转染BEAS-2B细胞，使SIRT6过表达，腺病毒转染24 h后用4μg/cm2MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h，采用实时荧光定量PCR检测MMP-2、MMP-9、COL3A1和TGF-β1的mRNA表达水平；通过Western blot检测MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平；通过 Transwell 迁移实验检测 BEAS-2B 细胞的迁移能力改变。使用腺病毒过表达野生型和无去乙酰化酶活性的突变体 SIRT6（H133Y）后用 4 μg/cm2 MWCNTs处理BEAS-2B细胞1 h，通过Western blot检测SIRT6对MWCNTs诱导的Smad2/3蛋白磷酸化的影响。<br>　　结果：1.MWCNTs理化表征和分散状态：MWCNTs外径8-15 nm，内径3-5 nm，长度10-50 μm，比表面积140.77 m2/g，纯度大于98%，所含金属杂质主要是Fe和Ni，分别占0.2%和0.5%。DLS结果显示，在72 h时MWCNTs团聚物的流体动力学直径最大，为356 nm，且此时的聚合物分散性指数（polymer dispersity index，PDI）为0.45。在0-72 h，MWCNTs的流体动力学直径和PDI没有显著变化，说明染毒0-72 h，MWCNTs在分散液中较稳定。<br>　　2. BEAS-2B细胞对MWCNTs的摄取：用4 μg/cm2的MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h后，TEM观察到MWCNTs进入细胞，且主要以团聚物的形式存在于细胞质的囊泡中。<br>　　3. MWCNTs 对 BEAS-2B 细胞 EMT 的影响：用 0.25 μg/cm2、1 μg/cm2和 4μg/cm2的MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h后，与对照组相比，上皮标志物E-cadherin在1μg/cm2和4μg/cm2浓度组时显著降低（P＜0.01）。间质标志物vimentin和α-SMA表达呈现浓度依赖式的升高(P＜0.05或P＜0.01)。<br>　　4. MWCNTs对BEAS-2B细胞中SIRT6蛋白表达的影响：用0.25 μg/cm2、1μg/cm2和4μg/cm2的MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h后，与对照组相比，SIRT6蛋白表达水平呈升高的趋势，并在4μg/cm2浓度组时显著升高（P＜0.05）。<br>　　5. 过表达或敲低SIRT6对BEAS-2B细胞EMT的影响：过表达SIRT6可以显著减弱MWCNTs诱导的EMT（P＜0.05或P＜0.01），但是敲低SIRT6对MWCNTs诱导的EMT无作用。<br>　　6. 过表达 SIRT6 对 MWCNTs 诱导的 EMT 相关细胞学行为的影响：过表达SIRT6显著抑制MWCNTs诱导的MMP-2、MMP-9、COL3A1和TGF-β1 mRNA的表达（P＜0.01），并显著抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表达（P＜0.05或P＜0.01）。同时MWCNTs诱导的BEAS-2B细胞迁移能力受到抑制（P＜ 0.01）。<br>　　7. 过表达 SIRT6 对 MWCNTs 激活的 TGF-β1/Smad2 通路的作用：4 μg/cm2 MWCNTs处理BEAS-2B细胞1 h后Smad2和Smad3蛋白磷酸化水平显著上调（P＜0.01）。过表达SIRT6可显著抑制MWCNTs诱导的Smad2蛋白磷酸化水平（P＜0.01），但对 Smad3 的蛋白磷酸化没有作用。无去乙酰化酶活性的突变体 SIRT6 （H133Y）未能减弱MWCNTs诱导的Smad2的蛋白磷酸化水平。<br>　　结论：不同浓度MWCNTs处理BEAS-2B细胞72 h，SIRT6蛋白表达水平随染毒浓度升高而逐渐升高。过表达SIRT6削弱了MWCNTs诱导的BEAS-2B细胞EMT。SIRT6通过失活TGF-β1/Smad2信号通路抑制MWCNTs诱导的EMT，且该过程依赖SIRT6的去乙酰化酶活性。