检索历史 清除

摘要G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs)是最大的膜表面受体家族，人类基因组有800多个GPCRs蛋白编码基因。GPCR介导的信号通路参与调控人类多种生理过程，GPCR功能失调与多种疾病的发生密切相关，因此该受体家族是非常重要的药物靶点。<br>　　GPCR被激活后可以偶联不同G蛋白介导经典的G蛋白依赖信号通路，G蛋白的激活会导致胞内产生第二信使，从而引发细胞内一系列生化反应。G 蛋白分为 4大类：Gs、Gi/o、Gq/11、G12/13。其中 Gs 和 Gq/11 亚型被激活后，分别会引起胞内第二信使 cAMP、Ca2+浓度的升高，与之相反，Gi 蛋白的激活会抑制腺苷酸环化酶活性，导致cAMP水平下降，但该信号无法直接进行检测，使Gi蛋白偶联受体相关研究相对繁琐。Gqi9蛋白是将Gq蛋白α亚基C端的9个氨基酸替换为Gi蛋白相对应的氨基酸，以此改变了G蛋白偶联GPCR的特异性，该嵌合体蛋白既可以被偶联 Gi 蛋白的受体激活，也可以介导 Gq 蛋白下游信号通路。Gqi9 蛋白的出现为 Gi蛋白偶联受体研究提供了有效的工具，目前都是采用Gqi9蛋白与受体共同转染的方式进行研究，但该方法具有表达不稳定以及表达不均一等缺点，因此本研究拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Gqi9基因敲入的HEK293细胞系，以实现Gqi9蛋白的稳定内源性表达。我们设计将 Gqi9 基因序列敲入目前使用最广泛的基因“安全港”AAVS1位点，研究报道该位点可以保证外源基因的正常转录，且在该位点插入外源基因对细胞无已知副作用。最后，在得到Gqi9基因敲入单克隆细胞系后，借助PCR、qPCR、荧光钙信号检测等方法对Gqi9基因表达以及Gqi9蛋白功能进行检测，实验结果显示该细胞系可以稳定表达Gqi9基因，且在该细胞系内外源表达偶联Gi蛋白的受体后可以检测到胞内钙信号的升高。<br>　　综上所述，本论文为Gi蛋白偶联受体的研究提供了有效的工具细胞系，克服了以往研究方法的缺点。该细胞系可以用于Gi蛋白偶联受体的结构与功能研究，也为针对该类受体的药物筛选以及多种突变体研究提供极大的便利，且本研究也为构建其它工具细胞系提供参考。