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摘要研究目的<br>　　1.临床研究：首先，探讨近端肾小管损伤标志物---a1-微球蛋白(urinary alpha1-microglobulin，ua1-MG)/尿肌酐(urinary creatinine，uCRE)及远端肾小管损伤标志物---尿表皮生长因子(urinary epidermal growth factor，uEGF)/uCRE与2型糖尿病患者尿微量白蛋白/尿肌酐(urinary microalbumin/creatinine ratio，uACR)的相关性。第二，探讨糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)气虚血瘀证与肾小管病变标志物的相关性。<br>　　2.实验一：基于DKD“气虚血瘀”的病机特点，探讨红景天水提取物对DKD大鼠肾纤维化的治疗作用。<br>　　3.实验二：探讨红景天苷对糖尿病大鼠肾损伤的保护作用。结合网络药理学，验证红景天苷抗高糖诱导的近端肾小管细胞凋亡的作用机制。<br>　　研究方法<br>　　1.临床研究：纳入125例2型糖尿病住院患者，收集临床资料，血生化指标，检测患者ua1-MG/uCRE、uEGF/uCRE及uACR。对患者进行中医辨证。根据患者uACR水平，分为单纯糖尿病组(n=75，uACR＜30mg/g)；DKD组(n=50，uACR＞30-300mg/g)。根据中医辨证，分为气虚血瘀组(n=61)及非气虚血瘀证组(n=64)。分析两组一般临床指标及肾小管损伤标志物变化。<br>　　2.实验一：选取Wistar大鼠32只，分为假手术组(sham组)，单侧肾切除组(unx组)，单侧肾切除+链脲佐菌素组(streptozotocin，STZ)(DKD组)，单侧肾切除+STZ+红景天水提取物组(DKD+RCE)组。红景天水提取物按0.5g/kg灌胃干预20周，检测各组大鼠24小时尿蛋白。病理染色计算各组大鼠肾小球系膜基质扩展指数及肾组织纤维化面积。免疫染色法检测各组大鼠肾皮质Ⅰ型胶原(collagen＜Ⅰ，COL-Ⅰ)、Ⅳ型胶原型(collagenⅣ，COL-Ⅳ)及纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、a-平滑肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，a-SMA)及转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β，TGF-β1)的表达水平。RT-PCR及westernblot检测各组大鼠肾皮质COL-Ⅰ、COL-Ⅳ、FN及TGF-β1mRNA及蛋白表达水平。<br>　　3.实验二：选取Wistar大鼠28只，分为假手术组(sham组)，单侧肾切除组(unx组)，单侧肾切除+STZ组(DKD组)，单侧肾切除+STZ+红景天苷组(DKD+SAL组)。红景天苷按70mg/kg灌胃干预8周。检测各组大鼠24小时尿微量白蛋白。病理染色评价肾小球系膜增生面积及肾小管损伤评分。免疫染色检测各组大鼠中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)表达情况。网络药理学预测红景天苷治疗DKD的可能机制。通过体内体外实验，利用TUNEL染色及AnnexinV-FITC/P验证红景天抗高糖诱导的肾小管细胞凋亡作用。利用Westernblot及免疫染色法检测红景天苷对凋亡靶蛋白BIM、BAX、cleavecaspase-3表达的影响。<br>　　研究结果<br>　　1.临床研究：<br>　　①DKD组患者ua1-MG/uCRE水平高于单纯糖尿病组，P＜0.01；uEGF/uCRE水平低于单纯糖尿病组，P＜0.05。<br>　　②Spearman分析：ua1-MG/uCRE与uACR呈高度正相关，P＜0.01；uEGF/uCRE与uACR呈低度负相关(P＜0.05)。<br>　　③多元logistic回归分析：校正危险因素后，ua1-MG/uCRE和2型糖尿病患者出现uACR异常呈正相关，即[OR1.053(95% CI1.017–1.091)，P=0.004]。uEGF/uCRE和2型糖尿病患者出现uACR异常呈负相关，[OR0.903(95% CI0.824–0.990)，P=0.030]。<br>　　④DKD患者气虚血瘀证比例高于单纯糖尿病组，P＜0.05。<br>　　⑤2型糖尿病气虚血瘀证组患者糖化血红蛋白、血胱抑素、uACR、ua1-MG/uCRE水平高于非气虚血瘀证组，分别P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01；高密度脂蛋白水平(high-density lipoprotein，HDL-C)及uEGF/uCRE水平低于非气虚血瘀证组，均P＜0.05。<br>　　⑥Ua1-MG/uCRE和DKD气虚血瘀证呈正相关[OR1.145(95%CI 1.021–1.285)，P=0.021]。uEGF/uCRE和DKD气虚血瘀证呈负相关[OR0.728(95%CI0.571–0.928)，P=0.010]。<br>　　2.实验一：<br>　　①与DKD组相比，DKD+RCE组24-h尿蛋白水平，大鼠肾小球系膜基质扩展指数及肾组织纤维化面积均减少，分别P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01。<br>　　②与DKD组相比，DKD+RCE组大鼠肾皮质COL-Ⅰ、COL-Ⅳ、FN及a-SMA蛋白表达水平均降低，均P<0.01。DKD+RCR组大鼠肾皮质CollagenⅠ，CollagenⅣ及FibronectinmRNA表达水平均降低，分别P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05。<br>　　③与DKD组相比，DKD+RCE组TGF-β1蛋白及mRNA表达水平均降低，分别P＜0.05，P＜0.01。<br>　　3.实验二：<br>　　①与DKD组相比，DKD+SAL组大鼠24-h尿微量白蛋白，大鼠肾系膜扩张面积及肾小管损伤评分降低，分别P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05。<br>　　②与sham组及unx组相比，DKD组NGAL蛋白表达升高，均P＜0.01；与DKD组相比，DKD+SAL组NGAL蛋白表达水平下降，P＜0.01。<br>　　③网络药理学预测红景天苷治疗DKD作用机制可能与调节细胞凋亡，炎症反应及细胞外基质降解相关。<br>　　④体内研究，TUENL染色结果显示：与sham组及unx相比，DKD组大鼠肾小管细胞凋亡数明显增加，均P＜0.01；DKD+SAL组肾小管细胞凋亡数较DKD组明显减少，P＜0.01。<br>　　⑤体外研究，TUENL染色及AnnexinV-FITC/PI结果显示：与高糖组相比，分别干预24h，48h，72h，红景天苷可减少高糖诱导的HK-2细胞凋亡，均P＜0.01。<br>　　⑥与对照组相比，干扰HK-2细胞BIM蛋白表达，可减少高糖诱导HK-2细胞凋亡，P＜0.01。<br>　　⑦体内研究，westernblot结果显示：与DKD组相比，DKD+SAL组BIM、BAX、cleavedcaspase-3蛋白表达水平均下降，分别P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01。<br>　　⑧体外研究，westernblot结果示：与高糖组相比，红景天苷干预组BIM、BAX、cleavedcaspase-3蛋白表达水平均下降，均P＜0.01。<br>　　研究结论<br>　　1、临床研究<br>　　①2型糖尿病患者，ua1-MG/uCRE，uEGF/uCRE与uACR的变化密切相关性，提示两者是评价2型糖尿病肾损伤的潜在标志物。<br>　　②与2型糖尿病非气虚血瘀证患者相比，气虚血瘀证患者糖化血红蛋白、血胱抑素、uACR、ua1-MG/uCRE水平增加；HDL-C及uEGF/uCRE水平下降。<br>　　③DKD组患者证素以气虚血瘀证素为主。Ua1-MG/uCRE和uEGF/uCRE是评价DKD患者气虚血瘀证的潜在指标。<br>　　2．实验一：红景天水提取物可以减少DKD大鼠尿蛋白，抑制DKD大鼠肾脏纤维化，其作用机制与抑制TGF-β1有关。<br>　　3．实验二：红景天苷可以减轻糖尿病大鼠肾损伤，其机制部分归因于抑制BIM蛋白调控的近端小管细胞凋亡。