内皮祖细胞与脐静脉内皮细胞外泌体MiRNA表达谱差异及miRNA-221-3p对糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的促进作用研究-论文-万方医学网

内皮祖细胞与脐静脉内皮细胞外泌体MiRNA表达谱差异及miRNA-221-3p对糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的促进作用研究

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摘要背景 　　糖尿病皮肤溃疡是糖尿病患者由于神经血管病变导致微循环障碍而发生的溃疡和坏疽，往往迁延难愈，使患者预期寿命及生活质量显著下降。然而，糖尿病伤口愈合延迟或缺乏愈合的原因仍不清楚，并且可加速或促进其修复的治疗方法仍然有限。内皮细胞在血管生成中起重要作用，在血管生成时，血管内皮细胞被快速激活并迁移到远处位点进行增殖，从现有毛细血管形成新的初级毛细血管以促进组织修复，内皮功能障碍是糖尿病微血管和大血管并发症的基础。外泌体和miRNA是参与糖尿病发病机制的重要分子，这些分子可以通过靶向参与糖尿病发病不同阶段的细胞和分子途径来发挥其作用。已经有研究报道，内皮祖细胞分泌的外泌体对血管内皮损伤的修复作用，但其具体分子机制仍未阐明。 　　目的 　　(1)探究内皮祖细胞外泌体和人脐静脉内皮细胞外泌体miRNA表达谱及差异。 　　(2)明确内皮祖细胞外泌体对糖尿病皮肤损伤的修复作用。 　　(3)探究内皮祖细胞外泌体中包含的miRNA-221-3p对糖尿病皮肤损伤的修复作用和机制。 　　方法 　　(1)细胞免疫荧光实验 　　将诱导成的内皮祖细胞孵育CD133、FlK-1抗体，然后孵育二抗，用荧光显微镜观察免疫荧光情况。 　　(2)内皮祖细胞外泌体和脐静脉细胞外泌体miRNA高通量测序 　　分别从原代培养的内皮祖细胞和脐静脉细胞提取的外泌体，进行miRNA建库和上机测序后，将原始数据过滤后使用相应软件进行定性和定量。 　　(3)细胞划痕实验 　　将胸主动脉内皮细胞使用miRNA-221-3p转染处理后12小时在显微镜下进行观察和拍摄，观察细胞的运动及迁移能力改变。 　　(4)免疫组化实验 　　将对照组和实验组小鼠处死，取伤口愈合处真皮层皮肤组织进行免疫组化，观察真皮层CD31、Ki67、VEGF和PCNA表达量的改变情况。 　　结果 　　(1)免疫荧光实验结果显示，两个标志性蛋白CD133和FlK-1皆呈阳性，显示内皮祖细胞被诱导分化成功。 　　(2)通过人脐静脉内皮细胞和内皮祖细胞外泌体miRNA高通量测序结果显示，内皮祖细胞外泌体与人脐静脉内皮细胞外泌体在miRNA表达谱上有明显差异,并通过差异靶基因的功能和信号通路分析，显示出内皮祖细胞外泌体miRNA的主要功能。 　　(3)通过构建小鼠皮肤损伤模型，涂抹内皮祖细胞外泌体或miRNA-221-3p观察皮肤愈合情况，发现外泌体和miRNA-221-3p都可以促进正常小鼠和糖尿病小鼠伤口愈合。 　　(4)免疫组化结果显示，内皮祖外泌体和miRNA-221-3p孵育后的糖尿病皮肤损伤模型的皮肤处CD31、Ki67、VEGF和PCNA显著增加，并且新生血管增多。 　　(5)细胞划痕实验结果显示，miRNA-221-3p可以显著增强胸主动脉内皮细胞的迁移能力。 　　结论 　　(1)内皮祖细胞外泌体和miRNA-221-3p可以促进糖尿病小鼠伤口愈合,并且导致CD31，Ki67、VEGF和PCNA蛋白表达增加，新生血管生成增加。 　　(2)miRNA-221-3p可以促进胸主动脉内皮细胞迁移能力。