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摘要目的:<br>　　大气PM2.5作为空气污染物之一，与肺癌的发生发展有着明显的关联，本研究探讨Wnt/β-catenin信号通路在大气PM2.5引起人支气管上皮细胞(Beas-2B)、非小细胞肺癌细胞(A549 )p16抑癌基因启动子甲基化改变中的关键作用；探讨Wnt/β-catenin信号通路在大气PM2.5引起上述两种细胞生物行为改变中的作用。分别用正常支气管上皮细胞、肺癌细胞建模进行体外实验，从致癌、促癌两个角度研究大气PM2.5对肺癌的相关分子机制。<br>　　方法:<br>　　根据课题组前期大气PM2.5采集方法，采集大气PM2.5，干燥、称重后溶解于DMSO，将其浓度定为100mg/mL备用。不同浓度大气PM2.5染毒Beas-2B、A549细胞24小时后，MTT、细胞划痕及Transwell实验确定细胞染毒浓度；同样以MTT实验确定DKK-1抑制剂最佳浓度；Westernblot法检测经不同浓度PM2.5处理及加入抑制剂DKK-1与PM2.5共孵育后细胞中Wnt/β-catenin通路各蛋白、DNA甲基化转移酶1(DNMT1)以及EMT相关蛋白表达水平；RT-qPCR法检测细胞中Wnt/β-catenin通路各因子mRNA及DNA甲基化转移酶(DNMTs)mRNA表达水平；甲基化特异性PCR(MSP)法检测细胞中p16抑癌基因甲基化水平;细胞划痕实验检测抑制剂DKK-1与PM2.5共孵育后A549细胞迁移力水平改变；Transwell实验检测加入抑制剂DKK-1与PM2.5共孵育后A549细胞侵袭力水平改变。<br>　　结果:<br>　　Wnt/β-catenin通路在大气PM2.5引起A549细胞p16甲基化及细胞生物行为学改变中的作用<br>　　1.MTT实验确定染毒及DKK-1剂量。染毒处理24h后，当剂量为100μg/mL时细胞存活率接近81%，且与对照组相比有统计学意义(P＜0.01)。故本研究选择染毒剂量包括0、25、50、100μg/mL，且染毒时间定在24h。随着DKK-1浓度增高，细胞存活率呈下降趋势，当DKK-1剂量为50ng/mL，细胞存活率为94%，与对照组相比无统计学差异。<br>　　2.PM2.5引起细胞甲基化水平上升。与对照组相比，随着染毒剂量升高，DNMT1蛋白表达水平及p16基因甲基化水平上升，且染毒浓度为100μg/mL时，效应最强(P＜0.01)。<br>　　3.PM2.5引起细胞生物行为学改变。与对照组相比，当染毒浓度为25、50μg/mL时，细胞迁移力相比明显增加(P＜0.01)，当染毒浓度继续上升至100μg/mL时，细胞迁移力无明显改变。相比于对照组，25μg/mL的染毒组，细胞侵袭力增强，但随着PM2.5浓度继续升高至50、100μg/mL时，侵袭力明显下降(P＜0.01)。故将细胞分为0、6.25、12.5、25μg/mL四组，检测细胞EMT蛋白水平，与对照组相比，随着染毒剂量的提高，Vimentin蛋白表达水平上调而E-cadherin蛋白表达水平下降(P＜0.01)。<br>　　4.PM2.5激活Wnt/β-catenin信号通路。随着染毒剂量提升，p-GSK-3β/GSK-3β比值及β-catenin、p-GSK-3β蛋白表达水平上调而APC蛋白表达水平下降。<br>　　5.DKK-1抑制PM2.5激活的Wnt/β-catenin信号通路。与单独染毒组相比，PM2.5与DKK-1共孵育组p-GSK-3β/GSK-3β比值及β-catenin、p-GSK-3β蛋白表达水平下降而APC蛋白表达水平上调，并皆具有统计学意义(P＜0.01)。<br>　　6.DKK-1抑制PM2.5激活的Wnt/β-catenin信号通路后p16甲基化及细胞生物行为学改变。与单独染毒组相比，PM2.5与DKK-1共孵育组DNMT1蛋白表达水平及p16甲基化水平下降，且细胞迁移力及侵袭力下降，EMT蛋白Vimentin表达水平下降而E-cadherin蛋白表达上调(P＜0.01)。<br>　　Wnt/β-catenin通路在大气PM2.5引起Beas-2B细胞p16甲基化及EMT蛋白表达水平改变中的作用<br>　　1.MTT实验确定染毒及DKK-1剂量。染毒处理24h后，当剂量为100μg/mL时细胞存活率接近75%，且与对照组相比有统计学意义(P＜0.01)。故本研究选择染毒剂量包括0、25、50、100μg/mL，且染毒时间定在24h。随着DKK-1浓度增高，细胞存活率呈下降趋势，当DKK-1剂量为50ng/mL，细胞存活率为93%，与对照组相比无统计学差异。<br>　　2.PM2.5引起细胞甲基化水平上升。与对照组相比，随着染毒剂量升高，DNMT1蛋白、DNMT3bmRNA表达水平及p16基因甲基化水平上升，且染毒浓度为100μg/mL时，效应最强(P＜0.01)。<br>　　3.PM2.5引起细胞EMT蛋白水平改变。与单独TGF-β1处理组相比，随着染毒剂量升高，Vimentin蛋白表达水平上调而E-cadherin蛋白表达水平下降(P＜0.01)。<br>　　4.PM2.5激活Wnt/β-catenin信号通路。随着染毒剂量提升，p-GSK-3β/GSK-3β比值及β-catenin、p-GSK-3β蛋白表达水平上调而APC蛋白、APCmRNA及DKK-1mRNA表达水平下降(P＜0.01)。<br>　　5.DKK-1抑制PM2.5激活的Wnt/β-catenin信号通路。与单独染毒组相比，PM2.5与DKK-1共孵育组p-GSK-3β/GSK-3β比值及β-catenin、p-GSK-3β蛋白表达水平下降而APC蛋白及mRNA表达水平上调，并皆具有统计学意义(P＜0.01)。<br>　　6.DKK-1抑制PM2.5激活Wnt/β-catenin信号通路后p16甲基化及细胞EMT蛋白水平改变。与单独染毒组相比，PM2.5与DKK-1共孵育组DNMT1蛋白、DNMT3bmRNA表达水平及p16甲基化水平下降，且EMT蛋白Vimentin表达水平下降而E-cadherin蛋白表达上调(P＜0.01)。<br>　　结论:<br>　　从促癌的角度阐释了大气PM2.5染毒A549细胞24h后，A549细胞抑癌基因p16甲基化水平上升，细胞EMT蛋白表达水平上升，细胞侵袭力、迁移力增强，并且Wnt/β-catenin通路参与到PM2.5诱导的p16基因甲基化水平上升及细胞生物行为学改变的过程中；此外从诱癌的角度阐释了染毒正常Beas-2B细胞后，p16基因甲基化水平上升，细胞EMT蛋白表达水平上升，且Wnt/β-catenin通路同样参与到此过程中。从诱癌、促癌两个角度研究大气PM2.5对肺癌的相关分子机制，进一步为细颗粒物暴露导致肺癌的防治提供新思路和新靶点。