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摘要糖尿病是一种常见的慢性疾病，容易导致并发症。由于需要长期用药，给患者造成了巨大的经济负担。流行病学的研究表明，糖尿病能够显著增加患结肠肿瘤的风险，但是其分子机制尚不明确。在肿瘤细胞中，中心体扩增是常见的现象，且与肿瘤的发生与发展存在明确的相关性。然而，有关糖尿病、肿瘤和中心体扩增之间存在何种关系且机制如何仍属空白。<br>　　鉴于此，本学位论文在临床水平和细胞水平就相关问题展开了研究。<br>　　1.临床水平<br>　　首先，选取了12例正常人和32例糖尿病患者，对他们血液的生理生化指标做了检测，结果发现，两类人群的空腹血糖、糖化血红蛋白和体重指数均存在显著差异；使用淋巴细胞分离液对外周血单核细胞进行分离，并通过免疫荧光染色计数中心体数目，结果显示，中心体扩增率在糖尿病患者组较健康人群组上升了2.6倍(8.7%±2.54%vs3.4%±1.49%，p＜0.05)；按照空腹血糖10mM对糖尿病样本进行分组，观察发现，中心体扩增率在三种组群，即健康人群组、糖尿病空腹血糖＜10mM组、糖尿病空腹血糖＞10mM组分别为：3.4%±1.49%、7.3%±2.4%、10.9%±1.9%(p＜0.05)；将所有样本的糖化血红蛋白与中心体扩增率进行回归分析，线性关系显著，R2=0.6448(p＜0.01)；仅糖尿病组中心体扩增率和糖化血红蛋白做回归分析，线性关系显著，R2=0.2381(p＜0.01)。<br>　　其次，对结肠肿瘤与糖尿病合并结肠肿瘤患者的瘤组织，及手术切缘组织的石蜡切片进行免疫荧光染色，并分析组织中心体扩增比例，结果显示，结肠肿瘤组中心体扩增率为：8.9%±1.7%，结肠肿瘤合并糖尿病组中心体扩增率为：16.7%±1.7%，p＜0.01，无糖尿病结肠肿瘤切缘组与合并糖尿病肿瘤切缘组中有丝分裂指数为：0.03%±0.01%与0.08%±0.07%，差异显著(p＜0.05)。结肠肿瘤组和结肠肿瘤合并糖尿病组有丝分裂指数分别为：0.86%±0.47%、2.3%±1.08%，差异显著(p＜0.01)。<br>　　2.细胞水平<br>　　基于以上研究发现的临床现象，就糖尿病能够增加结肠肿瘤组织细胞中心体扩增的机制进行了研究。使用糖尿病的病理生理因素：葡萄糖(Glu)、自由脂肪酸(棕榈酸(Pal))和胰岛素(Ins)，处理结肠肿瘤细胞HCT116，并对其引起的细胞中心体扩增能力进行了研究；进而又研究了糖尿病病理生理因素引起中心<br>　　体扩增的分子机制。<br>　　第一，使用葡萄糖、棕榈酸、胰岛素，以单因素或多因素的方式处理HCT116细胞48h后，HCT116细胞的中心体扩增率依次为：三因素＞双因素＞单因素；活性氧(ROS)抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)可显著抑制由病理生理因素引起的中心体扩增。<br>　　第二，将三因素处理的HCT116细胞进行高通量表达谱检测，并进行生物信息学分析。筛选被激活的丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)或mRNA水平高表达基因、14-3-3σ、Rho相关激酶1(ROCK1)进行研究。结果显示，siRNA干扰AKT蛋白表达量，或抑制剂LY294002抑制其活性，可显著抑制中心体扩增；siRNA抑制ROCK1、14-3-3σ蛋白表达量可显著抑制中心体扩增；使用westernblot检测了ROS、AKT、ROCK1和14-3-3σ在信号转导中的上下游关系；免疫荧光染色发现，ROCK1、14-3-3σ定位于中心体，ROCK1对14-3-3σ的中心体定位具有调节能力。<br>　　第三，针对ROCK1的中心体定位现象，使用蛋白质免疫共沉淀技术，富集与ROCK1存在相互作用的蛋白或复合体，使用LC-MS/MS技术进行鉴定；对鉴定的蛋白进行功能聚类、蛋白质互作网络分析、亚细胞定位分析和基于TCGA的肿瘤mRNA水平表达量分析及预后分析。生物信息学分析结果显示，KIF2A、DCTN2均可定位在中心体，并位于同一个复合体中，而文献的报道尚未表明它们与ROCK1存在相互作用；通过蛋白质免疫共沉淀使证实，ROCK1与DCTN2-KIF2A复合体之间存在相互作用，使用ROCK1的抑制剂GSK269962A封闭ROCK1激酶结构，放大了糖尿病病理生理因素引起的中心体扩增，且造成了KIF2A蛋白水平的显著下降。蛋白质免疫共沉淀结果显示，抑制剂GSK269962A不能阻断ROCK1与KIF2A-DCTN2的相互作用。<br>　　第四，使用DiscoveryStudioversion3.5，进行ROCK1对KIF2A及ROCK1抑制剂GSK269962A分子对接，结果表明，ROCK1可与KIF2A进行良好的对接，DOCKvalue=20.32，ROCK1抑制剂GSK269962A与ROCK1的对接良好，CDOCKER_ENERGY得分在18.85。<br>　　第五，研究了糖尿病患者体内显著升高的晚期糖基化终末产物(AGEs)对HCT116细胞中心体扩增的影响。<br>　　①对糖尿病患者体内的AGEs含量进行了检测，荧光法或ELISA法检测均显示，糖尿病患者体内的AGEs显著升高，且两种检测方法间存在显著的线性关系，在一定程度上可进行简单的换算；使用葡萄糖与牛血清白蛋白(BSA)制备了BSA-AGEs，并对制备的AGEs的分子质量、荧光光谱、细胞结合能力，以及促进细胞增殖等基本特性进行了检测，结果表明，制备的AGEs与文献报道一致；制备的AGEs处理细胞后能够以时间、剂量依赖的方式引起HCT116细胞的中心体扩增。AGEs处理后细胞周期发生显著变化，总体体现为：G1期细胞数量下降，S期或G2期细胞比例显著上升；常见的中心体扩增相关蛋白PLK4、AuroraA、MDM2在处理后发生显著上调，Rb、p53表现为总蛋白含量下降及蛋白功能的丧失；使用AGEs受体RAGE的抗体封闭细胞表面受体，或siRNA干扰RAGE表达后，p53、Rb总蛋白量水平回升，MDM2蛋白表达量显著降低。<br>　　②在研究中发现，与结肠肿瘤发生相关的Krueppel样转录因子5(KLF5)，在AGEs处理后总蛋白水平不变，核蛋白水平增加。siRNA干扰降低KLF5蛋白水平后可显著抑制AGEs引起的中心体扩增。运用转录组手段，研究KLF5在AGEs引起中心体扩增中的作用，结果发现，KLF5与MDM2的表达之间存在相关性，降低KLF5蛋白水平后可显著抑制MDM2的表达量，抑制MDM2同样可抑制中心体的扩增。<br>　　③选用染色质免疫共沉淀(CHIP)技术，就HCT116细胞中KLF5对MDM2的直接转录现象进行了研究与探讨。结果显示，在AGEs处理12h后，KLF5直接结合到MDM2的转录调控区，直接调节了MDM2的转录。构建Ⅰ型糖尿病小鼠模型，KLF5和MDM2在糖尿病小鼠的结肠中表达量均显著增加，使用小鼠结肠部分进行CHIP实验，结果显示，在糖尿病状态下，KLF5可结合到小鼠MDM2的转录调控区，直接促进了MDM2的表达；进一步使用AGEs长期处理永生化非癌的肠细胞系IEC6发现，IEC6细胞体积增大，边界更加明显，在平板培养中出现复层生长现象，在软琼脂平板培养内形成克隆，但不具备裸鼠体内成瘤的能力，表明AGEs处理的细胞可脱离接触抑制。<br>　　综上，全文结论如下：<br>　　(1)糖尿病促进了外周血单核细胞中心体扩增率增加，促进了结肠肿瘤组织中心体的扩增；<br>　　(2)病理生理因素葡萄糖、棕榈酸、胰岛素，可通过AKT/ROS/ROCK1/14-3-3σ信号通路引起HCT116结肠肿瘤细胞的中心体扩增。<br>　　(3)ROCK1在中心体结合KIF2A-DCTN2复合体并调节中心体扩增；<br>　　(4)病理生理因素AGEs可通过KLF5-MDM2途径促进细胞中心体扩增。使用AGEs长期处理永生化非癌的IEC6细胞，可促进其发生表型上的变化并克服细胞的接触抑制。