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摘要背景<br>　　宫颈癌(Cervical cancer，CC)是常见的妇科恶性肿瘤之一，也是全球女性癌症死亡的第四大原因。经典Wnt/β-catenin信号通路的异常激活增强了CC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，是CC发生发展的重要原因之一。但是作为Wnt配体的辅助受体，LRP5在CC发病中的确切作用尚未得到充分证实，需要进一步探究。<br>　　目的<br>　　探讨激活或敲除LRP5基因后对CC细胞的影响，进而揭示LRP5基因在CC发病中的作用和分子机制。<br>　　方法<br>　　1.免疫组化：采用免疫组织化学染色方法对宫颈癌石蜡组织芯片进行染色，检测LRP5蛋白在正常组织及CC组织中的表达水平。<br>　　2．构建LRP5基因敲除或激活的CC稳转细胞株<br>　　a)质粒准备：购买可敲除LRP5基因的LRP5CRISPR/Cas9KO质粒，激活LRP5基因的LRP5CRISPRAct质粒以及两者的对照质粒。<br>　　b)筛选细胞：将HeLa细胞接种到6孔板中，用LRP5CRISPR/Cas9KO质粒(NC-KO作为对照质粒)或LRP5CRISPRAct质粒(NC-Act作为对照质粒)转染细胞，之后用嘌呤霉素连续筛选。提取细胞RNA，通过qRT-PCR分析LRP5基因的上调或下调情况。<br>　　c)筛选单克隆稳转细胞株：通过流式细胞仪将经嘌呤霉素筛选的单个细胞分选至96孔板中并不断扩增。通过qRT-PCR和WesternBlot分析鉴定LRP5基因的变化情况，选择与对照组相比LRP5基因下调最明显的LRP5-KOHela单克隆稳转细胞和LRP5基因上调最明显的LRP5-ActHela单克隆稳转细胞，并进行后续实验。<br>　　d)体外实验：用筛选的单克隆稳转细胞进行细胞增殖实验、细胞集落形成实验、细胞划痕愈合实验、流式细胞仪检测细胞周期实验以及顺铂敏感性实验。<br>　　3.鉴定激活或敲除LRP5基因对Hela细胞体内成瘤能力的影响<br>　　a)细胞准备：分别扩大培养稳转的LRP5-KO或LRP5-ActHeLa细胞及其相应的对照组细胞。<br>　　b)注射裸鼠：在裸鼠双侧腹股沟和腋窝部位的皮下注射HeLa细胞混悬液。从注射当天起，每隔两天测量肿瘤大小，之后麻醉处死小鼠并剥离瘤体，测定各组肿瘤组织的重量。<br>　　c)分析验证：提取肿瘤组织的RNA，进行qRT-PCR分析，再次确定瘤体LRP5基因的表达情况。<br>　　结果<br>　　1.免疫组织化学结果显示：与正常宫颈组织相比，LRP5蛋白在CC组织中的表达水平增高。<br>　　2.qRT-PCR结果显示：激活HeLa细胞中的LRP5基因后，其mRNA水平升高，经典Wnt/β-catenin信号通路中的下游基因如CTNNB1、CyclinD1、CD44、COX2和c-Myc的mRNA水平均发生上调；另外，激活LRP5基因会上调IL-6和STAT3的mRNA水平。相反，敲除HeLa细胞中的LRP5基因，其mRNA水平显著降低，其下游基因的mRNA水平也发生下调，同时会降低IL-6和STAT3的mRNA水平。<br>　　3.WesternBlot结果显示：激活HeLa细胞中的LRP5基因会上调其蛋白表达水平，其下游基因CyclinD1和c-Myc的蛋白表达水平也升高；另外，激活LRP5基因会促进IL-6诱导的STAT3蛋白的磷酸化水平(p-STAT3)。相反，敲除LRP5基因会下调LRP5、CyclinD1和c-Myc的蛋白表达水平，同时会抑制IL-6诱导的p-STAT3蛋白的表达水平。<br>　　4.细胞增殖实验结果显示：激活LRP5基因增强了HeLa细胞的增殖能力；相反，敲除LRP5基因抑制了HeLa细胞的增殖能力。<br>　　5.细胞集落形成实验显示：激活LRP5基因，HeLa细胞的体外克隆形成能力增强；相反，敲除LRP5基因HeLa细胞的体外克隆形成能力减弱。<br>　　6.细胞划痕愈合实验显示：激活LRP5基因增强了HeLa细胞的迁移能力；相反，敲除LRP5基因抑制了HeLa细胞的迁移能力。<br>　　7.流式细胞仪检测细胞周期结果显示：敲除LRP5基因，HeLa细胞S期细胞数目减少，G2/M期细胞数目增多，HeLa细胞被阻滞于G2/M期。<br>　　8.药物敏感性实验结果显示：激活或敲除LRP5基因并不影响HeLa细胞对顺铂的敏感性。<br>　　9.裸鼠体内成瘤实验结果显示：激活LRP5基因会增强HeLa细胞在裸鼠体内的成瘤能力；相反，敲除LRP5基因会明显降低HeLa细胞的体内成瘤能力。<br>　　结论<br>　　1.LRP5蛋白在CC组织中表达增高，其表达水平与CC患者的生存时间呈负相关；<br>　　2.激活LRP5基因，可能通过激活经典Wnt/β-Catenin信号通路和IL-6/STAT3信号通路，增强CC细胞的增殖、迁移及体内外成瘤能力；<br>　　3.敲除LRP5基因，可能通过抑制经典Wnt/β-Catenin信号通路和IL-6/STAT3信号通路，抑制CC细胞的增殖、迁移及体内外成瘤能力；<br>　　4.LRP5基因可能是CC诊断和治疗潜在的作用靶点。