DHCR24在大鼠耳蜗中的表达及作用机制研究-论文-万方医学网

DHCR24在大鼠耳蜗中的表达及作用机制研究

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摘要世界卫生组织统计超过3.6亿人饱受耳聋的影响，给个人生活和社会都造成了严重的负担。感音神经性聋是耳科的常见病、多发病，毛细胞和螺旋神经元损失是引起感音神经性聋的主要原因，其损伤后难以再生，导致永久性听力损失。如何保护毛细胞或螺旋神经元免受损伤，充分了解其损伤机制进行保护干预具有重要的研究意义。 　　第一部分基底膜培养药物损伤模型的建立 　　目的 　　基底膜体外培养，建立耳毒性药物损伤基底膜毛细胞或螺旋神经元模型，以便于进行药物性聋机制的研究。 　　方法 　　1.取P0、P1、P2和P3大鼠仔鼠基底膜进行体外培养，随机分为正常对照组和顺铂(10μM)损伤组，连续培养48h后基底膜免疫荧光染色观察。2.取P0和P3大鼠基底膜培养，随机分为正常对照组和氨基糖苷类损伤组，氨基糖苷类抗生素包括新霉素、庆大霉素和卡那霉素，设置不同的药物浓度梯度，免疫荧光染色观察损伤情况。3.取P0和P3大鼠基底膜培养，随机分为正常对照组和新霉素损伤组，进行MitoSoxRed检测和CleavedCaspase-3染色，探讨耳毒性药物损伤基底膜可能的作用机制。 　　结果 　　P0、P1、P2和P3大鼠基底膜体外培养，一定浓度的顺铂，同时损伤毛细胞和螺旋神经元，建立稳定的药物损伤基底膜模型；而且随着仔鼠日龄的增加，同等浓度的顺铂损伤基底膜逐渐加重，即P3基底膜相较于P0顺铂损伤程度明显加重。P0和P3大鼠基底膜培养，氨基糖苷类损伤，观察发现氨基糖苷类损伤毛细胞从基底膜底转开始，随着浓度增加，逐渐损伤到基底膜顶转；同等浓度氨基糖苷类，P3相较于P0损伤在基底膜各转都更加严重。卡那霉素，可以同时损伤基底膜毛细胞和螺旋神经元，P3相比P0损伤更加严重。新霉素损伤基底膜，MitoSoxRed检测与CleavedCaspase-3染色，P3染色反应明显增强。 　　结论 　　取固定天数大鼠耳蜗的基底膜进行体外培养，一定浓度的耳毒性药物损伤，可以建立稳定的基底膜药物性损伤模型。随着耳毒性药物浓度的增加，基底膜损伤加重，可以根据实验需要选择合适的药物浓度。P0和P3基底膜培养，P0基底膜相较于P3对耳毒性药物损伤具有更强的耐受，其可能与ROS介导的细胞凋亡有关。 　　第二部分DHCR24在大鼠耳蜗毛细胞中的表达及作用研究 　　目的 　　观察DHCR24在耳蜗Corti器中是否表达和细胞定位，顺铂引起毛细胞损失后的表达变化，并探讨DHCR24的作用及作用机制。 　　方法 　　1.新生P1的SD大鼠，取耳蜗及其他组织进行WB，明确DHCR24是否在耳蜗中表达。2.新生P1的SD大鼠，耳蜗组织切片和基底膜铺片观察DHCR24在Corti器中的细胞定位。3.新生P1的SD大鼠基底膜培养，随机分为正常对照组和顺铂处理组，观察顺铂引起的毛细胞损失及DHCR24的表达变化。4.新生P1的SD大鼠基底膜培养，顺铂损伤同时加入不同浓度DHCR24的抑制剂U18666A进行干预，观察抑制DHCR24的表达后顺铂引起的毛细胞损失的变化，明确DHCR24的作用。5.新生P1的SD大鼠基底膜培养，随机分为4组：第一组为正常对照组，第二组为顺铂处理组，第三组为顺铂处理+U18666A组，第四组为U18666A组。检测加入DHCR24的抑制剂U18666A进行干预后，基底膜DHCR24、ROS和cleaved-caspas-3表达变化，探讨DHCR24在顺铂引起毛细胞损失中的作用机制。 　　结果 　　DHCR24在大鼠各组织中广泛表达。免疫荧光染色发现DHCR24在大鼠耳蜗Corti器的毛细胞中表达。体外基底膜培养中，顺铂引起毛细胞损失，底转毛细胞损失较顶转毛细胞严重，建立体外药物损伤模型。顺铂造成毛细胞损失，同时引起DHCR24在毛细胞中的表达上调。加入DHCR24的抑制剂U18666A，发现抑制DHCR24的表达之后顺铂引起的毛细胞损失加重，且同时引起ROS和cleaved-caspas-3表达上调。 　　结论 　　DHCR24在新生大鼠耳蜗Corti器毛细胞中表达，抑制DHCR24的表达加重了顺铂引起的毛细胞损失，表明DHCR24对毛细胞有保护作用。抑制DHCR24的表达，增加了顺铂损伤引起的基底膜上ROS和cleaved-caspase-3表达，阐明了DHCR24可能通过抑制毛细胞线粒体内的氧化应激损伤，进而抑制DNA损伤和细胞凋亡从而起到保护听觉细胞的作用。 　　第三部分DHCR24在大鼠耳蜗螺旋神经元中的表达及作用研究 　　目的 　　观察DHCR24在耳蜗螺旋神经节中是否表达和细胞定位，顺铂引起螺旋神经元损失后的表达变化，并探讨DHCR24可能发挥的作用。 　　方法 　　1.不同天数SD大鼠(P1、P14和P28)，取耳蜗进行冰冻组织切片，免疫荧光染色观察DHCR24在螺旋神经节表达。2.新生P1的SD大鼠，基底膜和细胞培养，免疫荧光染色观察，进一步明确DHCR24在螺旋神经节表达部位。3.新生P1的SD大鼠基底膜培养，加入顺铂，观察螺旋神经元损伤情况；顺铂损伤同时加入不同浓度DHCR24的抑制剂U18666A进行干预，观察抑制DHCR24的表达后顺铂引起的螺旋神经元损失的变化，明确DHCR24的作用。 　　结果 　　耳蜗冰冻切片免疫荧光染色，发现DHCR24在P1、P14和P28大鼠耳蜗螺旋神经元中表达。体外基底膜和细胞培养中，再次验证了DHCR24在P1大鼠耳蜗螺旋神经元中表达。体外基底膜培养，顺铂会引起螺旋神经元损伤；添加DHCR24的抑制剂U18666A，发现抑制DHCR24的表达之后顺铂引起的螺旋神经元损失加重。 　　结论 　　大鼠从出生到形成正常听力，DHCR24在大鼠耳蜗螺旋神经元中表达。体外基底膜培养，抑制DHCR24的表达会加重顺铂引起的螺旋神经元损失，表明DHCR24可能对螺旋神经元有保护作用。