检索历史 清除

摘要研究背景<br>　　脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,其中胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM,WHOⅣ级)在脑胶质瘤中约占54%,具有易复发、侵袭能力强的特点,中位生存期只有12-15个月.由于GBM多呈恶性、浸润性生长,外科手术常常难以彻底切除.放射治疗在GBM的治疗中占有极其重要的地位,术后放疗可以有效杀伤残余肿瘤细胞从而延长患者的无进展生存期和总生存期.对于无法进行手术切除的GBM,也能釆取放疗的方法抑制肿瘤细胞生长,改善患者的临床症状和生活质量,且放疗对脑功能的损害也低于外科手术.然而,较其它类型脑胶质瘤患者,GBM患者的放疗效果往往不是很理想,且更易出现放疗抵抗和肿瘤复发.大量文献研究显示,GBM放疗抵抗的发生可能与DNA损伤修复、胶质瘤干细胞(gliomastem cells, GSCs)、自噬以及肿瘤微环境变化等有关,它是一个多因素多环节共同作用的复杂机制过程.因此,系统阐明参与GBM放疗抵抗的病理机制,对于提高GBM患者的放疗敏感性以及抑制患者复发具有重要的临床意义.<br>　　研究目的<br>　　寻找参与GBM放疗抵抗的关键分子及相关通路并阐明其作用机制,为增强GBM患者放疗敏感性以及逆转放疗抵抗提供潜在的药物靶点.<br>　　研究方法<br>　　1.首先,利用人源肿瘤异种移植模型(Patient-Derived tumor Xenograft, PDX)构建一种能够反映临床病理特征的放疗抵抗模型,并从中分离出放疗抵抗细胞亚群(Radiation-tolerat persister cells,RTPcells);<br>　　2.通过CCK-8、克隆形成、3D侵袭、迁移以及mRNA测序等实验明确RTP细胞的生物学功能;<br>　　3.对PDX放疗抵抗模型进行miRNAs的差异筛选,发现miR-103a是显著下调的miRNA之一,在RTP细胞和TCGA数据中验证miR-103a的表达情况;<br>　　4.利用生物信息学、WesternBlot、双荧光素酶报告基因、单细胞凝胶电泳以及干细胞球形成等技术系统阐明miR-103a在RTP细胞中发挥的功能与分子机制;<br>　　5.通过生物信息学、表观遗传学、转录因子芯片、染色质免疫共沉淀等技术阐明miR-103a在RTP细胞中下调的分子机制;<br>　　6.通过CCK-8、克隆形成、免疫荧光、单细胞凝胶电泳以及干细胞球形成等实验明确NF-κB-YY1-miR-103a通路在RTP细胞中的功能;<br>　　7.在临床GBM样本中通过免疫组织化学和miRNA原位杂交等实验评价NF-κB-YY1-miR-103a通路与患者放疗敏感性、复发的相关性;<br>　　8.将miR-103a制备成能够靶向GBM的纳米粒子,并在原位胶质瘤模型中验证其对放射敏感性的影响.<br>　　研究结果<br>　　1.我们成功构建了一种能够反映临床病理特征的GBM放疗抵抗PDX模型,并从中分离出了具有放疗抵抗特性的细胞亚群(RTP),随后证实放疗抵抗细胞亚群具有更强的恶性表型;<br>　　2.在放疗抵抗的RTP细胞中DNA损伤修复和GSCs自我更新通路发生了最为显著的变化;<br>　　3.miRNA差异筛选发现miR-103a在RTP细胞中显著下调,并在多种细胞系形成的RTP细胞中证实了筛选结果的准确性,TCGA数据库也证实miR-103a在GBM中低表达;<br>　　4.过表达miR-103a能够增强RTP细胞的放疗敏感性,进一步的研究发现miR-103a能够直接抑制XRCC3和FGF2的表达,一方面XRCC3能够增强GBM细胞的DNA损伤修复能力,另一方面FGF2可以促进GSCs的自我更新,从而形成miR-103a对RTP细胞DNA损伤修复和GSCs自我更新能力的双重调节;<br>　　5.NF-κB和YY1是我们筛选得到的在RTP细胞中被显著激活的转录因子,生物信息学分析显示miR-103a启动子区存在YY1的结合位点,YY1可以抑制miR-103a的转录,进一步的研究发现活化的NF-κB可以通过促进YY1的转录激活负向调控miR-103a的表达;<br>　　6.NF-κB-YY1-miR-103a通路通过影响DNA损伤修复和GSCs自我更新介导了RTP细胞在放疗抵抗中的功能;<br>　　7.GBM样本的免疫组织化学以及原位杂交检测结果显示,P65、YY1、FGF2和XRCC3在复发的GBM患者中显著升高,而miR-103a在复发的GBM患者中显著降低.Spearman相关性分析显示,miR-103a与FGF2、XRCC3、YY1以及p65的表达水平均呈负相关,而p65与YY1、FGF2及XRCC3均呈正相关,YY1与FGF2及XRCC3也呈正相关,上述相关性分析进一步证实了NF-κB-YY1-miR-103a通路在GBM患者样本中的存在;<br>　　8.转铁蛋白修饰的miR-103a纳米粒子可以通过血脑屏障靶向原位胶质瘤并增强其放疗敏感性.<br>　　结论<br>　　我们成功的构建了一种能够模拟临床病理特征的放疗抵抗PDX模型,随后分离出了具有放疗抵抗特性的RTP细胞,并证实RTP细胞中存在NF-κB-YY1-miR-103a调节通路,即放射治疗可以诱导NF-κB的持续活化,而活化的NF-κB可以促进YY1的转录激活,YY1通过负向调控miR-103a上调了XRCC3和FGF2的表达水平,XRCC3增强了细胞的DNA损伤修复能力,FGF2增强了GSCs自我更新能力,最终导致了RTP细胞的放疗抵抗.该通路的发现及其分子机制的阐明为增强GBM放疗敏感性以及逆转放疗抵抗提供了潜在的药物靶点.