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摘要应激与人类健康密切相关，适度的应激可调动防御机制对机体有利，但持续过高强度的慢性应激会在生理、心理和行为等方面对机体产生不良影响，甚至引起多种应激性疾病。研究表明，持续较高强度的应激负荷可造成机体损伤，影响个体健康、降低工作效率、导致疲劳；甚至会诱发多种疾病，发生猝死等极端事件。研究表明，75%～90%的人类疾病和应激有关。心血管是应激所致损伤的首要靶器官，多种应激动物模型(如噪声、电击、束缚、湿热和力竭游泳等)均证实，应激可引起心肌损伤和血管内皮功能障碍，引发或加重心血管疾病。<br>　　飞行人员作为一个特殊群体，长期应对航空特殊环境(噪声、振动、加速度、缺氧等)和特殊情况(雷暴、大风等特殊气象，空中发动机故障等特殊事件)所造成的各种心理生理应激。飞行人员所面临的应激因素更加复杂、刺激强度更加强大、危害程度更加严重。飞行人员虽然经过层层严格健康选拔，但心血管病还是时有发生，且心血管病后果严重，减少飞行寿命，甚至危及飞行安全。调查发现，我国军事飞行员高血压患病率在2.5～9.8%，而高血压前期人数比例却高达38.1%。然而，目前关于飞行应激损伤机制和防护措施研究还相对比较滞后，尚远远不能满足航空事业飞速发展的现实需要，特别是国内对应激损伤干预手段还主要以精神心理卫生干预为主、药物治疗为辅，非药物措施十分缺乏，因此寻找一种安全、无创、简单、快速、有效，具有防应激、抗疲劳作用的措施办法显得更加迫切和重要。<br>　　水疗法(Hydrotherapy)作为一种传统康复疗法具有无创、安全、高效等特点，主要利用水对人体产生的温度、机械和化学刺激，达到治疗和预防疾病的目的。当前水疗在运动医学和康复医学领域发展迅速。临床实践表明，水疗对高血压、类风湿性关节炎、脑瘫等多种疾病以及亚健康的预防和康复具有明显有益效果，同时也被应用于高水平运动员运动后疲劳和损伤的恢复。可能主要与水的温热效应促进血液循环、调控细胞代谢、诱导热休克蛋白的合成与释放、降低氧化应激反应等有关。然而，国内外对于不同温度水疗干预是否能够缓解慢性应激及其造成的心血管损伤尚未见报道。我国关于水疗的应用虽然具有悠久历史，但长期以来水疗在现代医学和军事医学中的作用未被充分认识和应用，国内外虽有研究观察了水疗后人体生理生化指标的改变，仍缺乏系统性的基础理论研究，针对水疗的生物学效应和机制尚未完全阐明。因此，本研究拟通过构建慢性应激大鼠动物模型，观察不同温度水疗干预对慢性应激损伤尤其是心血管损伤的影响，探寻最优的抗慢性应激损伤水疗干预方案，并研究其机制。<br>　　实验目的<br>　　1.观察热水浴、冷水浴、常温水浴和冷热交替水浴4种不同温度水疗干预方案对大鼠慢性应激损伤的防护效果。<br>　　2.研究特定水疗干预方案的在慢性应激所致心血管损伤中的保护效应及机制。<br>　　实验方法<br>　　1.建立慢性应激动物模型：选取8周龄成年雄性SD大鼠，采用噪声复合足底电击刺激诱导大鼠应激模型，电流强度3～5mA，随机间隔2～20s，持续电击1～2s，随机电击结束当天夜间继续给予持续噪声(200～2000Hz，80～100dB)，每天电击4小时(上下午各1次，每次2小时)，噪声刺激4小时，共持续28天。<br>　　2.水疗干预方案：每天下午大鼠电击刺激结束，自由饮食休息1小时后给于水疗干预处理，水疗在特制塑料圆筒(直径20cm，高60cm)中进行，水深10～25cm，时间10min。水温根据具体实验分组方案分别设定，其中热水浴(Hot water immersion，HWI)水温38~40℃；冷水浴(Cold water immersion，CWI)水温13~15℃；常温水浴(Thermoneutral water immersion，TWI)水温34~36℃；冷热交替水浴(Contrast water therapy，CWT)的热水温38~40℃，冷水温13~15℃，热水2min后换入冷水1min，交替循环3次，共10min。<br>　　3.血压测量：隔天于电击结束后2h使用智能无创血压计测量各组大鼠的尾动脉收缩压(SBP)和舒张压(DBP)，每隔4天测量1次，每只大鼠测量5次取平均值。<br>　　4.血清激素和炎症因子等测定：采用ELISA法测定血清中应激激素皮质醇(Cor)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、去甲肾上腺素(NE)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)含量，应激28天后采用30g/L戊巴比妥钠按50mg/kg腹腔注射麻醉，取腔静脉血，离心，检测血清Cor、AngⅡ、NE、TNF-α、CK和LDH含量。<br>　　5.测定肠系膜血管收缩和舒张功能：使用微血管灌流仪(DMT)对大鼠肠系膜微动脉进行功能检测。血管初始预负荷设置为2mN，稳定1h，随后用60mmol/LKCl溶液作用血管2次，选取收缩幅度相差＜10％，且张力大于lmN的血管。血管功能测定时，采用浓度累加法，分别加入血管舒张和收缩试剂。最后，根据舒张程度和数值，评定血管舒张和内皮功能；根据收缩程度和数值，评定血管平滑肌收缩功能。<br>　　6.免疫荧光染色：石蜡切片脱蜡，蒸馏水和PBST漂洗，正常血清封闭液室温封闭20min，滴加LC3Ⅱ一抗工作液。湿盒内37℃恒温箱内孵育1小时，PBST漂洗，滴加二抗工作液，湿盒内37℃恒温箱内孵育20min，PBST漂洗后滴加荧光素工作液，湿盒内37℃恒温箱内孵育30min，避光保存，PBST充分漂洗，滴加20～50μlDAPI，充分漂洗后用封片剂进行封片。倒置荧光显微镜观察，采集图像。<br>　　7.透射电镜及线粒体数目测算：将新鲜心肌组织切成1mm3的组织块，置于30ml/L戊二醛磷酸缓冲液中，4℃避光固定。梯度乙醇脱水和丙酮浸5min，Epon812包埋，制成超薄切片，在透射电镜下观察心肌线粒体超微结构并测算数目。<br>　　8.Westernblotting检测蛋白水平：采用RIPA提取大鼠左心室和腹主动脉血管组织蛋白，BCA法进行蛋白定量。将蛋白样品(每孔5-10μL)行SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜。在50g/L脱脂牛奶中室温封闭1h，加入相应一抗(1∶1000)4℃孵育过夜，洗去多余一抗后加入相应二抗，37℃孵育1h，洗去多余二抗后使用ECL-Plus试剂盒进行化学发光检测，β-actin为各组内参对照。用成像软件系统(aplegen Omega Lum C)进行条带光密度值分析。<br>　　9.行为学实验：旷场实验和高架十字迷宫实验均在安静的环境下进行，分别将大鼠放入旷场反应箱内底面中心/高架十字迷宫中心，同时开启摄像并计时，旷场实验和高架十字迷宫实验均观察5min后停止摄像。<br>　　10.采用GraphPadPrismversion8.0统计软件进行统计学分析。实验结果表示为平均数±标准差，P＜0.05为差异有统计学意义。<br>　　实验结果<br>　　1.噪声复合足底电击28天能够成功构建大鼠慢性应激损伤模型。与对照组大鼠相比，应激组大鼠存在明显应激反应和心血管损伤，主要表现为体重显著降低(P＜0.01)、血糖明显升高(P＜0.05)、血压明显升高(P＜0.05)，血清Cor、NE、AngⅡ、TNF-α、ADMA浓度和CK、LDH水平升高(P＜0.05)；血清中NO含量降低(P＜0.05)；心肌组织自噬相关蛋白LC3Ⅱ/I、p62、Beclin1表达增加(P＜0.05)，线粒体数量减少并呈现结构紊乱。此外，旷场实验和高架十字迷宫实验结果表明大鼠自发活动行为及探索行为明显减少，焦虑增加。<br>　　2.不同温度水疗干预对大鼠慢性应激的效应各不相同，长期热水浴干预改善慢性应激的效果最佳。与应激组大鼠相比，每天仅10分钟的热水浴干预，就能显著降低大鼠全身的慢性应激反应，减缓应激大鼠的体重下降，加速应激后血糖水平的恢复，逆转应激大鼠的血压升高(P＜0.05)，降低应激大鼠焦虑水平，改善应激大鼠自发活动和探索行为(P＜0.05)。此外，冷热交替水浴也可逆转应激大鼠的血压升高，但起效较晚，直到干预末期(24天)才出现血压降低(P＜0.05)。而其他温度水疗干预对应激大鼠体重、血压、血糖和行为学等均无明显影响(P＞0.05)。<br>　　3.热水浴能有效改善慢性应激大鼠血管内皮功能。与应激组大鼠相比，热水浴组大鼠内皮依赖的血管舒张显著改善，血清NO水平升高(P＜0.05)、ADMA浓度下降(P＜0.05)，血管组织eNOS磷酸化水平、DDAH1表达水平增加(P＜0.05)。在培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中每天10分钟40℃孵育能较好模拟热水浴对血管内皮的效应，体现为温热孵育使应激激素处理后HUVECs分泌NO增加，ADMA浓度下降，DDAH1表达增加，使用siDDAH1可特异性阻断DDAH1表达，从而增加ADMA浓度，降低NO分泌水平。<br>　　4.热水浴能有效减轻慢性应激大鼠心肌损伤。与应激组大鼠相比，热水浴组大鼠CK、LDH水平降低，p62和Beclin1表达水平减少(P＜0.05)，心肌线粒体结构损伤亦有所逆转。<br>　　结论<br>　　1.本研究首次发现，长期热水浴较冷水浴、常温水浴和冷热交替水浴等其他温度水浴能有效减轻大鼠慢性应激状态。<br>　　2.热水浴降低慢性应激诱发的血压升高，其机制与热水浴增加内皮DDAH1表达、降低内源性eNOS抑制物ADMA生成，从而增加内皮NO生物利用度有关。<br>　　3.热水浴调控应激所致心肌细胞自噬紊乱和促进心肌线粒体结构恢复，减轻慢性应激性心肌损伤。热水浴可望作为缓解慢性应激、预防应激性高血压和心肌损伤的有效防护手段。