检索历史 清除

摘要目的：<br>　　课题组既往与OriMAbs公司合作通过酵母展示技术筛选出一株可特异性识别PSMA抗原胞外段的PSMA单链抗体(gy1 )，将其改造为人源性PSMA抗体(PSMAb)，并证实其可特异性结合并内化进入PSMA阳性前列腺癌细胞。TRIM24的表达在原位前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌中呈逐渐上升趋势，并可在雄激素极低的条件下通过激活雄激素受体信号通路从而促进CRPC细胞增殖，提示TRIM24是CRPC理想的治疗靶点。本研究中，我们将PSMA抗体与鱼精蛋白进行化学偶联制备PSMAb-sulfo-SMCC-protamine(PSP)偶联物，并评估了PSP偶联物结合及靶向输送siRNA的有效性，及其携带针对TRIM24siRNA在体外和体内对CRPC的治疗效果。<br>　　方法：<br>　　1．制备PSP偶联物及PSP-FAMsiRNA(PSPS)复合物。<br>　　2.凝胶电泳和荧光测定法检测PSP偶联物装载及释放siRNA的效率。<br>　　3.流式细胞术及免疫荧光检测PSP偶联物和PSPS复合物结合及内化入CRPC细胞的能力。<br>　　4.小动物荧光活体成像检测PSP和PSPS复合物在体内的分布及靶向输送siRNA的能力。<br>　　5.qRT-PCR、免疫印迹、免疫荧光检测PSP-TRIM24siRNA复合物在体内和体外对TRIM24表达的干扰效率。<br>　　6.CCK-8、平板克隆形成实验、流式细胞术、细胞划痕实验及Transwell检测PSP-TRIM24siRNA复合物对CRPC细胞增殖、克隆形成、凋亡、周期、侵袭及迁移能力的影响。<br>　　7.小动物生物发光活体成像、X线、小动物CT检测PSP-TRIM24siRNA复合物在体内对肿瘤生长及骨丢失的影响。TUNEL和Ki-67染色检测PSP-TRIM24siRNA复合物在体内水平对细胞凋亡和增殖的影响。<br>　　8.体重测量、肝肾功检测、H&E染色评估多次反复注射PSP-TRIM24siRNA复合物的初步安全性。<br>　　结果：<br>　　1.凝胶电泳结果显示PSP可结合siRNA并在细胞内释放siRNA。荧光测量显示1moLPSP偶联物约可结合5moLFAM-siRNA。凝胶电泳和荧光测量显示PSP偶联物可保护siRNA使其免于被消化。<br>　　2.流式细胞术和免疫荧光结果显示PSP可特异性与PSMA阳性前列腺癌细胞结合，不能与PSMA阴性细胞结合，PSP可特异性内化进入PSMA阳性细胞中。此外，PSPS可靶向输送siRNA至PSMA阳性细胞。<br>　　3．ICG标记的PSP和PSPS在尾静脉注射6h后可迅速分布于全身及肿瘤组织，而后逐渐被清除。但在96h时，仍可在PSMA阳性肿瘤组织中检测到ICG标记的PSP和PSPS。组织器官及肿瘤组织成像显示ICG标记的PSP和PSPS可特异性分布于PC-3-PSMA+肿瘤组织，而在阴性组织中检测不到。此外，在肝肾等代谢器官和肺脾等血供丰富的器官也可检测到ICG标记的PSP和PSPS。<br>　　4．TRIM24与PSMA的表达水平在前列腺癌组织中均上调，并呈正相关。<br>　　5．与对照组相比，PSP-TRIM24siRNA复合物处理组C4-2细胞中，TRIM24表达显著下降。PSP-TRIM24siRNA复合物处理组C4-2细胞的增殖能力、克隆形成能力均较对照组显著降低，细胞凋亡水平及G1期细胞百分比均较对照组显著升高。此外，与对照组相比，PSP-TRIM24siRNA复合物处理组C4-2细胞的迁移距离、侵袭及迁移细胞数目均显著减少。<br>　　6．在皮下荷瘤裸鼠模型中，与对照组相比，PSP-TRIM24siRNA复合物处理后，PC-3-PMSA+荷瘤裸鼠中，TRIM24的表达显著下降。与PBS及IgG-TRIM24siRNA组相比，PSP-NC及PSP-TRIM24siRNA复合物治疗组肿瘤增殖速度变慢、肿瘤体积变小、肿瘤重量变轻、TUNEL染色荧光强度增强、Ki-67荧光强度减弱。其中，PSP-TRIM24siRNA复合物治疗效果优于PSP-NC组。H&E染色显示PC-3-PSMA+细胞荷瘤裸鼠中，PSP-TRIM24siRNA复合物治疗后瘤体中可检测到组织形态异常。<br>　　7．在CRPC骨转移模型中，与PBS及IgG-TRIM24siRNA组相比，PSP-TRIM24siRNA复合物处理后，PC-3-PMSA+裸鼠肿瘤诱导的骨质破坏显著减轻。其中，PSP-TRIM24siRNA复合物抑制骨质破坏疗效果更佳。<br>　　8.给予5次尾静脉注射PSP-TRIM24siRNA复合物后，裸鼠体重、肝肾功能、重要器官组织形态均无显著改变。<br>　　结论：<br>　　本研究结果显示PSPS复合物可在体内外保护siRNA免于被消化，并可在体内及体外水平特异性结合并内化进入PSMA阳性前列腺癌细胞。此外，PSP-TRI24siRNA复合物介导的TRIM24靶向沉默可抑制PSMA阳性CRPC细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡及阻碍细胞周期。研究还发现PSP-TRIM24siRNA复合物可通过促进凋亡并抑制增殖而延缓PSMA阳性CRPC细胞荷瘤裸鼠的肿瘤生长。更为重要的是，PSP-TRIM24siRNA复合物可减轻PSMA阳性CRPC细胞骨转移模型的骨质破坏。