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摘要瞬时外向钾电流(Ito)是心肌细胞动作电位复极1期的主要成分,能影响动作电位形态和动作电位时程.瞬时外向钾通道由孔区亚单位Kv4(Kv4.3或Kv4.2)形成的同源四聚体和辅助亚单位共同构成,目前比较公认的辅助亚单位是钾通道相互作用蛋白2(KChIP2)和二肽基肽酶样蛋白亚型6(DPP6).KChIP2在心脏表达分布以及在Ito通道中的功能已有较深入的了解,DPP6为单次跨膜蛋白,最初发现于中枢神经,能够加速Kv4电流的衰减和通道的复活.近年有报道,DPP6基因突变可引发家族特发性室颤(idiopathic ventricular fibrillation),我们前期的实验发现,DPP6中介通道调节剂NS5806对不同种属动物Ito不同的药理反应,提示DPP6辅助亚单位在心脏Ito通道的重要作用.然而目前DPP6在动物心脏的表达分布情况了解甚少.<br>　　已知DPP6存在多种剪接异构体,其中最常见的是DPP6-L(长)和DPP6-S(短)两种剪接体.本课题检测DPP6-L和DPP6-S在不同动物种属心脏、心脏不同区域的表达情况,预期为揭示DPP6的生理功能提供实验依据.<br>　　方法:<br>　　1.首先利用qRT-PCR方法,检测DPP6-L和DPP6-S在小鼠左心室中的mRNA表达.因为先期发现DPP6的mRNA在脑组织中有显著表达,因此本实验以小鼠的脑组织作为阳性对照.PCR引物基于N端胞内域不同的序列设计.<br>　　2.利用Westernblot方法,观察DPP6-L和DPP6-S在小鼠、大鼠、兔、犬心脏(不同部位)以及人诱导多潜能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CMs )中蛋白的表达.本实验所用的抗体是兔抗人DPP6的316~366氨基酸残基的多克隆抗体,可同时检测DPP6-L和DPP6-S.<br>　　3.观察Ito调节剂NS5806对离体心脏QTc(心率矫正后的QT)间期的影响,进一步在功能上验证DPP6对于Ito通道的调节作用.成年SD大鼠,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,迅速开胸取出心脏,置Langendorff灌流装置灌流,记录心电图(相当于体表心电图的Ⅱ导).稳定后观察10μMNS5806对心电图的影响,测量QT、RR间期,计算连续10个QRS波群的平均值,得出QTc(心率矫正后的QT)间期的变化.<br>　　结果:<br>　　1.DPP6在小鼠左心室的mRNA表达<br>　　小鼠脑组织中DPP6-S的mRNA表达量较高,DPP6-L有一定的mRNA表达,这和之前的文献报道相一致.然而,DPP6-L和DPP6-S在小鼠的左心室中mRNA表达量都较低,几乎检测不到.<br>　　2.DPP6在不同种属动物心脏的蛋白表达<br>　　由于缺乏DPP6-L和DPP6-S两种亚型的特异性抗体,我们基于以往报道脑组织中有DPP6-L和DPP6-S两种亚型表达,以DPP6-S为主,以小鼠的脑组织作为阳性对照,在脑组织中的条带中低表达且分子量稍大的条带为DPP6-L,分子量约为115KDa;高表达且分子量稍小的条带为DPP6-S,分子量约为105KDa.结果表明,在小鼠脑组织中以DPP6-S表达为主,DPP6-L的表达较少,这和之前的文献报道相一致.在小鼠左心室中以DPP6-L表达为主,DPP6-S几乎不表达;在hiPSC-CMs中以DPP6-L的表达为主,DPP6-S表达较少;在犬的左心室中以DPP6-S的表达为主,很少的DPP6-L表达.<br>　　已知心脏的Ito电流密度存在显著的区域差别,我们进一步检测了DPP6在心脏的不同部位的表达.结果表明,大鼠心脏(左室内膜下、中层和外膜下组织以及右心室、室间隔、心房),小鼠心脏(左室内膜下和外膜下组织以及右心室、室间隔、心房)以及兔心脏(左心室、右心室、左心房、右心房)等不同部位均以DPP6-L的表达为主,且其蛋白表达量在心脏不同部位并无显著性差异.<br>　　3.NS5806对Langendorff离体灌流大鼠心脏心电图的影响<br>　　10μMNS5806显著延长大鼠离体ECG的QTc间期,从给药前的139ms延长到给药后的265ms.给药前后采用配对t检验,求出均数和标准差,P<0.01,认为差别有统计学意义.<br>　　结论:DPP6在动物心脏有显著的蛋白表达,但存在种属差异.大鼠、小鼠及兔心脏表达DPP6-L,人源心肌细胞同时表达DPP6-L和DPP6-S,但以前者为主;相反犬心室肌主要表达DPP6-S.大鼠、小鼠以及兔心脏不同部位的DPP6-L的表达无明显差别.