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摘要阿尔兹海默症（AD）是一种慢性神经系统退行性疾病，常隐匿起病，随着年龄的增长逐渐加重。60-70%的痴呆都与此疾病有关，早期主要表现为近事遗忘，而后逐渐出现失语、空间障碍、情绪多变、行动不能等症状。聚集的β淀粉样蛋白（Aβ）和Aβ诱导的神经元凋亡在阿尔兹海默症的病理生理学中具有重要地位。既往研究发现，过多的蛋白质在AD病变神经元中聚集会激活未折叠蛋白反应（UPR），这是种病理现象，主要调节神经元细胞异常的内质网应激作用（ERstress）和凋亡途径。近期研究发现，一种从巴拿马海域蓝藻中分离的天然成分SantacruzamateA（STA），可通过增强PC12细胞内质网应激耐受，降低细胞中Aβ蛋白25-35肽段（Aβ25-35）诱导的毒性及改善APP/PS1双转基因（APPswe/PS1dE9）小鼠的认知障碍情况，这表明STA具有调节神经元内质网应激作用及凋亡相关进程最终改善阿尔兹海默症症状的潜在作用，本实验是为了探究其作用机制并验证STA的改善疾病作用。<br>　　材料与方法<br>　　STA购于SelleckChemicals公司（美国）。β淀粉样蛋白片段25-35（Aβ25-35）购于Sigma-Aldrich公司（美国）。从中国医学科学院获得PC12型和SH-SY5Y型神经肿瘤细胞并由本实验室离体培养。细胞培养于相应培养基中，根据实验需要，与不同浓度的化合物共孵育处理。采用CCK-8法检测细胞活力，AnnexinV/PI染色法、TUNEL染色和Caspase-3凋亡检测法STA的抗凋亡作用。采用蛋白质印记实验、免疫共沉淀实验、细胞转染实验检测STA对Aβ25-35对内质网应激及UPR相关因子水平的影响。运用钙黄绿素钴淬灭法及JC-1染色法分别检测STA对mPTP开放情况及MMPs的影响。最后将APP/PS1双转基因鼠分组进行行为学实验。所有实验均用SPSS统计软件v.17.0进行分析。所得结果记为平均值±标准差，每组分析结果至少由三次实验的平均值。用单样本Kolmogorov-Smirnov检验数据分布的正态性。如果数据是正态分布的，则统计学评价结果呈现单向方差分析(ANOVAs)。使用Tukey和LSD检验或Games-Howell检验进行多重验后比较。当数据分布不正常时，用Kruskal-Wallis检验分析组间差异，用Mann-WhitneyU检验分析对中位数之间的差异。当P＜0.05时被认为具有统计学意义。<br>　　结果<br>　　用CCK-8法测定不同浓度的STA对Aβ25-35处理后的PC12和SH-SY5Y细胞的影响。结果表明，单独的STA处理(0.01-50μM)不改变PC12和SH-SY5Y细胞的活性。STA预处理能显著降低PC12和SH-SY5Y细胞中Aβ25-35诱导的毒性作用。LDH释放量和caspase-3活性测定结果证实STA对Aβ25-35处理后的PC12细胞具有抗凋亡作用。通过annexinV/PI双重染色和TUNEL染色法进一步评价STA的抗凋亡作用，结果提示STA明显减少了Aβ25-35诱导的凋亡细胞和TUNEL阳性细胞的数量。<br>　　STA显著逆转(减弱)Aβ25-35诱导PC12细胞中PERK和IRE1α磷酸化及ATF6α的表达，证实了STA对UPR介质产生的影响。STA下调了Aβ25-35诱导的eIF2α磷酸化水平以及CHOP和ATF4的表达。实验结果表明，STA阻断了Aβ25-35激活的磷酸化的eIF2α-ATF4-CHOP通路。<br>　　STA逆转了Aβ25-35细胞内[Ca2+]i升高的荧光强度比值和caspase12的表达水平。此外，膜片钳记录显示STA部分逆转了Aβ25-35诱导放大的Ca2+电流。<br>　　免疫印迹分析表明，STA不改变内质网分子伴侣GRP78和GRP94的表达水平，但提高了PDI和KDELR的表达水平。<br>　　STA降低了线粒体中GRP78的水平，同时，GRP78和线粒体的免疫荧光共定位分析也证实STA抑制了Aβ25-35诱导的GRP78向线粒体的移位。<br>　　STA逆转了Aβ25-35诱导的mPTP过度开放现象及MMP去极化现象。随后，我们证明STA抑制了Aβ25-35诱导的动力相关蛋白1(Drp1)、线粒体裂变调节蛋白1(Fis1)和线粒体裂殖因子(Mff)的激活和招募，这些蛋白参与调节线粒体分裂和凋亡通路。<br>　　我们的研究提示，STA可能通过阻断分子伴侣转位至线粒体来减轻Aβ25-35对Mia40-ALR的影响。此外，STA还可抑制Aβ25-35诱导上调的激活型caspase-9水平，同时下调Aβ25-35诱导释放的细胞色素C、Smac和AIF的水平。<br>　　相对于野生型（WT）对照组，KDELR基因敲除明显减弱了STA诱导的细胞保护作用，提高了磷酸化PERK的水平，降低了内质网腔内GRP78的表达。<br>　　在旷场实验中，与野生型组相比，STA(5、10mg/kg)对APP/PS1组小鼠活动能力无明显影响。<br>　　在获得性实验中，在第2和第3阶段，WT组和APPswe/PS1dE9组在逃避潜伏期和目标象限花费的时间百分比上具有显著差异。结果表明，APPswe/PS1dE9小鼠定位平台的时间比WT小鼠长，这可能是由于其空间记忆能力下降所致。相比之下，STA显著缩短了逃避潜伏期，增加了2阶段和3阶段中花在目标象限的时间百分比。逃避潜伏期缩短，逃避率增高，说明STA减轻了APPswe/PS1dE9小鼠的空间学习障碍。在空间探查实验中，APPswe/PS1dE9小鼠的交叉次数明显低于WT小鼠，而STA显著提高了交叉次数。此外，STA能显著逆转APPswe/PS1dE9小鼠目标象限游泳时间缩短现象。在记忆维持实验的三个阶段中，APPswe/PS1dE9小鼠的逃避潜伏期和在目标象限花费的时间比均大于WT小鼠。与此相反，用不同浓度的STA处理APPswe/PS1dE9小鼠后，其逃避潜伏期显著减少，且在目标象限花费的时间比例增加。<br>　　为探究STA激活的KDELR和Mia40-ALR的功能及联想记忆与神经病理方面的潜在相关性，在APPswe/PS1dE9转基因小鼠完成行为学实验后，对各组小鼠脑组织进行免疫组织化学和免疫印迹分析。免疫印迹结果表明，STA增强了细胞中KDELR和Mia40的表达水平，而RT-PCR分析表明，STA仅上调了APPswe/PS1dE9小鼠脑组织中KDELR基因的转录水平，而不是Mia40。<br>　　结论<br>　　STA通过激活KDEL受体（KDELR）阻滞Aβ诱导的UPR和内质网应激。KDELR可增强内质网驻留蛋白驻扎在内质网膜上。并且STA可调节线粒体膜间隙装配蛋白40（Mia40）和肝再生增强因子（ALR）水平，因此下调线粒体的分裂和凋亡通路。同时我们发现，KDELR蛋白和Mia-ALR硫氧化还原系统，在Aβ诱导的神经毒性中起一定作用，并且以此对学习和记忆产生益处。这些现象充分肯定STA在AD的治疗领域将有广阔的应用前景。