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摘要目的:<br>　　乳腺癌是危害全球女性健康的第一杀手，化疗在乳腺癌的治疗过程中占有重要地位。但是，多药耐药（MultiDrugResistance，MDR）的出现导致化疗的失败，极大地限制了局部晚期和转移性乳腺癌的治疗效果。药物转运蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）能够将细胞内的化疗药物排出细胞外，其过量表达是MDR产生的主要原因之一。尽管在MDR细胞中关于P-gp的表达调控已被深入研究，但是目前对P-gp活性调控的研究还很少。Rack1（ReceptorforActivatedCKinase1）是细胞内的一种支架蛋白，介导不同蛋白质之间的相互作用，在肿瘤细胞抵抗化疗药物的过程中发挥重要作用。前期研究发现Rack1是P-gp的一个结合蛋白质，但是Rack1是否调控P-gp的转运活性，目前尚未可知。<br>　　本研究中，我们利用多药耐药的乳腺癌细胞系，通过一系列体外细胞学实验，结合构建体内耐药移植瘤模型，明确耐药细胞中Rack1对P-gp转运泵活性的调控作用，并进一步探究Rack1调控P-gp活性的分子机制，为改善临床晚期耐药乳腺癌的治疗以及寻找新的治疗靶点提供线索。<br>　　方法：<br>　　1.采用特异性的小干扰RNA下调耐药细胞系中Rack1的表达，WesternBlotting检测Rack1的敲减效果以及P-gp蛋白水平的变化。<br>　　2.通过CCK-8的方法，分析MDR乳腺癌细胞系中降表达Rack1后对化疗药物表柔比星的敏感性变化，并通过软件计算相应的IC50值。<br>　　3.将P-gp的荧光底物罗丹明123（Rhodamine，Rh123）加入细胞，孵育一段时间后，采用流式细胞技术检测下调Rack1前后细胞内Rh123的强度变化，分析P-gp转运活性的变化。<br>　　4.利用化疗药物表柔比星的荧光特性，将其加入细胞孵育一段时间后，采用荧光显微镜观察细胞内表柔比星的荧光强度，分析敲减Rack1前后MDR乳腺癌细胞内表柔比星的蓄积情况。<br>　　5.采用小干扰RNA技术，下调MDR乳腺癌细胞中Src的表达，免疫印迹法分析细胞内Src和P-gp的蛋白水平变化。<br>　　6.在敲减Src表达后的MDR乳腺癌细胞系中，分别采用CCK-8的方法检测细胞对表柔比星的敏感性，采用流式细胞分析技术检测P-gp的转运活性，采用免疫荧光的方法分析细胞内表柔比星的蓄积情况。<br>　　7.采用Src激酶家族特异性的抑制剂Saracatinib和Dasatinib，抑制Src的激酶活性，WesternBlotting分析total-Src、phosphor-Src以及P-gp的蛋白水平变化。<br>　　8.在MDR乳腺癌细胞系中抑制Src激酶活性后，分别采用CCK-8的方法分析细胞对化疗药物敏感性的变化，采用流式细胞技术分析细胞内Rh123的荧光强度及P-gp转运活性的变化，采用免疫荧光技术分析化疗药物在细胞内的蓄积情况。<br>　　9.采用小干扰技术敲减细胞内Rack1的表达，免疫共沉淀分析P-gp/Src/Cav1（Caveolin-1）之间的相互作用；敲减细胞内Src的表达，免疫共沉淀分析P-gp/Rack1/Cav1之间的相互作用。<br>　　10.构建表达针对Rack1非编码区序列的shRNA的慢病毒，构建稳定敲减Rack1的MDR乳腺癌细胞系。构建携带Flag标签的野生型Rack1WT和失去Src结合能力的Rack1Y246F突变体（将第246位的Y突变为F）表达质粒；在敲减Rack1的细胞中重新表达Rack1WT和Rack1Y246F，免疫共沉淀分析P-gp/Src/Cav1之间的相互作用。<br>　　11.WesternBlotting分析敲减Rack1和Src的表达或者抑制Src的激酶活性后对phosphor-Src和phosphor-Cav1的表达变化情况。<br>　　12.在稳定敲减Rack1的细胞中，分别采用Rack1WT和Rack1Y246F进行拯救，然后采用免疫印迹分析Rack1、total-Cav1、phosphor-Cav1的表达变化情况。<br>　　13.构建野生型的Cav1（Cav1WT）和模拟磷酸化持续激活的Cav1Y14E突变体表达质粒，在敲减Cav1的细胞中重新表达Cav1WT和Cav1Y14E，免疫共沉淀分析其与P-gp的结合能力；两种拯救的细胞中，分别加入Src激酶抑制剂，利用流式细胞技术分析P-gp的转运活性。<br>　　14.在重新表达Rack1WT和Rack1Y246F后，采用CCK-8的方法检测细胞对表柔比星敏感性的变化，采用流式细胞分析技术检测细胞内荧光强度的变化，分析P-gp转运活性的变化。<br>　　15.将Rack1敲减组及其对照组细胞，Rack1WT-和Rack1Y246F-拯救组及其对照组细胞，接种至裸鼠皮下构建移植瘤，然后采用表柔比星治疗，分析不同组之间的肿瘤体积差异。<br>　　结果：<br>　　1.敲减MDR乳腺癌细胞系中Rack1的表达后，P-gp的蛋白水平没有显著变化。<br>　　2.下调MDR乳腺癌细胞中Rack1的表达后，细胞对表柔比星的敏感性增加，IC50值降低。<br>　　3.敲减耐药细胞中Rack1的表达后，Rh123荧光分子阳性细胞的比例增加，说明P-gp的外排能力减弱。<br>　　4.敲减耐药细胞中Rack1的表达后，免疫荧光发现表柔比星在细胞中的蓄积量增加。<br>　　5.在MDR乳腺癌细胞系中下调Src的表达，P-gp的蛋白表达水平不受影响。<br>　　6.敲减耐药细胞Src的表达后，细胞对表柔比星的敏感性增加，IC50值降低；流式细胞技术检测Rh123荧光分子阳性细胞的比例增加，P-gp将Rh123转运到细胞外的能力下降；免疫荧光显示，表柔比星在细胞内的荧光强度增加。<br>　　7.Saracatinib和Dasatinib两种抑制剂均能以剂量-依赖性地抑制Src的激酶活性，但不影响Src的表达，也不影响P-gp的表达水平。<br>　　8.抑制Src的激酶活性后，耐药细胞对表柔比星的敏感性增加，IC50值下降；Rh123荧光分子在细胞内的蓄积量增加；免疫荧光发现细胞内表柔比星的荧光强度增加，表明P-gp的转运活性下降。<br>　　9.下调乳腺癌耐药细胞中Rack1的表达后，P-gp和Src的蛋白水平没有显著变化，但二者的结合能力下降，同时，P-gp与Cav1的相互作用增加；下调Src的表达后，P-gp与Rack1的相互作用不受影响，P-gp与Cav1的结合能力增加。<br>　　10.成功建立了Rack1稳定敲减的细胞系；在该细胞中外源性导入Rack1WT和Rack1Y246F突变体后，使得Rack1的表达水平恢复至接近内源性Rack1的水平；在Rack1敲减的细胞中，重新表达Rack1WT，恢复了P-gp和Src之间的相互作用，并抑制了P-gp与Cav1的结合；而重新表达Rack1Y246F突变体，不能够拯救P-gp和Src之间的相互作用，而且P-gp与Cav1之间仍有较强的相互作用。<br>　　11.敲减耐药细胞中Rack1和Src的表达，或者抑制Src的激酶活性，均能抑制Cav1的磷酸化，对Cav1的本底表达水平没有影响。<br>　　12.在稳定敲减Rack1表达的耐药细胞中，Cav1的磷酸化受到抑制，重新表达Rack1WT，可恢复细胞中Cav1的磷酸化，而Rack1Y246F突变体拯救组细胞，Cav1的磷酸化仍然受到抑制。<br>　　13.有效地敲减耐药细胞中内源性Cav1的表达，外源性的Cav1WT和Cav1Y14E突变体在该细胞中的表达水平接近内源性水平；相比于Cav1WT，Cav1Y14E突变体与P-gp的结合能力减弱；流式细胞结果分析敲减Cav1的表达，增强了P-gp的转运能力；与Cav1WT相比，重新表达Cav1Y14E突变体可促进Rh123的外排，P-gp的转运能力增加；此外，Cav1WT拯救组细胞中使用Src抑制剂后会显著抑制P-gp的转运活性，而突变体拯救组细胞中使用Src抑制剂后对P-gp转运活性的抑制效果不明显。<br>　　14.与Rack1Y246F相比，Rack1WT拯救的细胞能够恢复对表柔比星的抵抗，IC50值增加，P-gp转运Rh123的能力增加，Rh123阳性细胞所占比例增加。<br>　　15.在体内裸鼠耐药细胞移植瘤模型中，稳定敲减Rack1组和Rack1Y246F拯救组小鼠接受表柔比星处理后，肿瘤体积明显缩小；而Rack1WT拯救组小鼠肿瘤对表柔比星的治疗产生抵抗。<br>　　结论：<br>　　本次研究证明，乳腺癌耐药细胞中Rack1和Src的表达正调控P-gp转运活性，促进肿瘤细胞对化疗药物抵抗。Rack1作为支架蛋白，介导了Src和P-gp之间的相互作用。在此相互作用复合体中Src磷酸化Cav1，后者由非磷酸化状态到磷酸化状态的转变，导致其与P-gp的相互作用下降，P-gp的转运活性从抑制状态变为激活状态。敲减Rack1或者破坏Rack1/Src/P-gp之间的相互作用可抑制P-gp的转运泵活性，P-gp将化疗药物泵出细胞外的能力下降，细胞内药物蓄积增加，对药物的敏感性增加，耐药能力减弱。综上所述，Rack1可作为新的潜在的治疗靶点用于开发抗肿瘤药物，逆转肿瘤细胞多药耐药。