摘要目的:<br> 构建PLIN1基因敲除载体,敲除3T3-L1前脂肪细胞中PLIN1基因,有效降低PLIN1蛋白的表达,研究脂肪细胞中PLIN1基因敲除对脂肪水解的影响,并探究其机制。<br> 方法:<br> 1.利用CRISPR/Cas9技术,双酶切法构建PLIN1基因敲除载体,DNA测序技术鉴定载体;常规培养3T3-L1前脂肪细胞,PCR扩增PLIN1基因目的片段;sgRNA体外转录,Cas9体外酶切,鉴定sgRNA活性。<br> 2.电穿孔转染3T3-L1前脂肪细胞,嘌呤霉素筛选转染成功的细胞;优化的“鸡尾酒”法,诱导3T3-L1前脂肪细胞分化;Westernblot检测脂肪细胞中PLIN1蛋白的表达,RT-PCR检测PLIN1mRNA相对表达量,检验阳性载体的敲除作用。<br> 3.油红O染色脂肪细胞中脂滴,测量脂滴大小、读计脂滴数量;酶法测定脂肪细胞中甘油三酯和甘油含量,了解细胞脂解情况;Westernblot法检测细胞中脂解酶、Fsp27、PPARγ蛋白表达,RT-PCR检测细胞中HSL、ATGLmRNA相对表达量。<br> 结果:<br> 1.3个sgRNA均可以识别PLIN1基因靶点,发挥作用,体外酶切活性检测均有效;3个敲除载体的DNA测序结果均与预期一致。<br> 2.各组质粒纯度均介于1.8-2.0,浓度在1.5μg/μL左右;电转染后细胞存活率80%,嘌呤霉素4d杀死细胞的最低浓度是4μg/ml,嘌呤霉素筛选后细胞存活率为30%;完成敲除后,3个阳性敲除组细胞中PLIN1蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),PLIN1mRNA相对表达量均明显降低。<br> 3.诱导分化完成后,脂肪细胞中脂滴体积增大,在细胞核周围形成明显的“戒环样”结构;与对照组相比,PLIN1基因敲除组中大脂滴数量减少,小脂滴分布广泛,脂滴融合速度减慢;PLIN1基因敲除组细胞中甘油三脂含量(0.0310±0.0053mmol/gprotein)与对照组相比(空白对照组:0.1078±0.0039mmol/gprotein,阴性对照组:0.1256±0.0076mmol/gprotein)明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);PLIN1基因敲除组细胞中甘油含量(0.0984±0.0076mmol/gprotein)与对照组相比(空白对照组:0.0485±0.0131mmol/gprotein,阴性对照组:0.0376±0.0124mmol/gprotein)升高,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,PLIN1基因敲除组细胞中HSL、ATGL蛋白表达量与mRNA相对表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05);对照组与PLIN1基因敲除组细胞中Fsp27、PPARγ蛋白表达量没有明显差异。<br> 结论:<br> 1.成功构建3个PLIN1基因敲除载体,体外酶切活性检测均有效。<br> 2.3个PLIN1基因敲除载体均成功敲除3T3-L1前脂肪细胞中PLIN1基因。<br> 3.脂肪细胞中PLIN1基因敲除后,细胞脂解速度加快。<br> 4.脂滴表面失去PLIN1蛋白的屏障作用,而脂滴融合速度减慢,小脂滴数量增多,导致脂滴表面积增加,同时脂肪细胞中ATGL、HSL的蛋白表达增加等因素共同作用,导致脂肪细胞脂解速度加快。
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