• 医学文献
  • 知识库
  • 评价分析
  • 全部
  • 中外期刊
  • 学位
  • 会议
  • 专利
  • 成果
  • 标准
  • 法规
  • 临床诊疗知识库
  • 中医药知识库
  • 机构
  • 作者
热搜词:
换一批
论文 期刊
取消
高级检索

检索历史 清除

医学文献>>
  • 全部
  • 中外期刊
  • 学位
  • 会议
  • 专利
  • 成果
  • 标准
  • 法规
知识库 >>
  • 临床诊疗知识库
  • 中医药知识库
评价分析 >>
  • 机构
  • 作者
热搜词:
换一批

PLIN1基因敲除对3T3-L1细胞脂解的影响及机制探究

摘要目的:<br>  构建PLIN1基因敲除载体,敲除3T3-L1前脂肪细胞中PLIN1基因,有效降低PLIN1蛋白的表达,研究脂肪细胞中PLIN1基因敲除对脂肪水解的影响,并探究其机制。<br>  方法:<br>  1.利用CRISPR/Cas9技术,双酶切法构建PLIN1基因敲除载体,DNA测序技术鉴定载体;常规培养3T3-L1前脂肪细胞,PCR扩增PLIN1基因目的片段;sgRNA体外转录,Cas9体外酶切,鉴定sgRNA活性。<br>  2.电穿孔转染3T3-L1前脂肪细胞,嘌呤霉素筛选转染成功的细胞;优化的“鸡尾酒”法,诱导3T3-L1前脂肪细胞分化;Westernblot检测脂肪细胞中PLIN1蛋白的表达,RT-PCR检测PLIN1mRNA相对表达量,检验阳性载体的敲除作用。<br>  3.油红O染色脂肪细胞中脂滴,测量脂滴大小、读计脂滴数量;酶法测定脂肪细胞中甘油三酯和甘油含量,了解细胞脂解情况;Westernblot法检测细胞中脂解酶、Fsp27、PPARγ蛋白表达,RT-PCR检测细胞中HSL、ATGLmRNA相对表达量。<br>  结果:<br>  1.3个sgRNA均可以识别PLIN1基因靶点,发挥作用,体外酶切活性检测均有效;3个敲除载体的DNA测序结果均与预期一致。<br>  2.各组质粒纯度均介于1.8-2.0,浓度在1.5μg/μL左右;电转染后细胞存活率80%,嘌呤霉素4d杀死细胞的最低浓度是4μg/ml,嘌呤霉素筛选后细胞存活率为30%;完成敲除后,3个阳性敲除组细胞中PLIN1蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),PLIN1mRNA相对表达量均明显降低。<br>  3.诱导分化完成后,脂肪细胞中脂滴体积增大,在细胞核周围形成明显的“戒环样”结构;与对照组相比,PLIN1基因敲除组中大脂滴数量减少,小脂滴分布广泛,脂滴融合速度减慢;PLIN1基因敲除组细胞中甘油三脂含量(0.0310±0.0053mmol/gprotein)与对照组相比(空白对照组:0.1078±0.0039mmol/gprotein,阴性对照组:0.1256±0.0076mmol/gprotein)明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);PLIN1基因敲除组细胞中甘油含量(0.0984±0.0076mmol/gprotein)与对照组相比(空白对照组:0.0485±0.0131mmol/gprotein,阴性对照组:0.0376±0.0124mmol/gprotein)升高,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,PLIN1基因敲除组细胞中HSL、ATGL蛋白表达量与mRNA相对表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05);对照组与PLIN1基因敲除组细胞中Fsp27、PPARγ蛋白表达量没有明显差异。<br>  结论:<br>  1.成功构建3个PLIN1基因敲除载体,体外酶切活性检测均有效。<br>  2.3个PLIN1基因敲除载体均成功敲除3T3-L1前脂肪细胞中PLIN1基因。<br>  3.脂肪细胞中PLIN1基因敲除后,细胞脂解速度加快。<br>  4.脂滴表面失去PLIN1蛋白的屏障作用,而脂滴融合速度减慢,小脂滴数量增多,导致脂滴表面积增加,同时脂肪细胞中ATGL、HSL的蛋白表达增加等因素共同作用,导致脂肪细胞脂解速度加快。

更多
广告
  • 浏览0
  • 下载0

加载中!

相似文献

  • 中文期刊
  • 外文期刊
  • 学位论文
  • 会议论文

加载中!

加载中!

加载中!

加载中!

特别提示:本网站仅提供医学学术资源服务,不销售任何药品和器械,有关药品和器械的销售信息,请查阅其他网站。

  • 客服热线:4000-115-888 转3 (周一至周五:8:00至17:00)

  • |
  • 客服邮箱:yiyao@wanfangdata.com.cn

  • 违法和不良信息举报电话:4000-115-888,举报邮箱:problem@wanfangdata.com.cn,举报专区

官方微信
万方医学小程序
new翻译 充值 订阅 收藏 移动端

官方微信

万方医学小程序

使用
帮助
Alternate Text
调查问卷