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摘要目的：<br>　　构建PLIN1基因敲除载体，敲除3T3-L1前脂肪细胞中PLIN1基因，有效降低PLIN1蛋白的表达，研究脂肪细胞中PLIN1基因敲除对脂肪水解的影响，并探究其机制。<br>　　方法：<br>　　1.利用CRISPR/Cas9技术，双酶切法构建PLIN1基因敲除载体，DNA测序技术鉴定载体；常规培养3T3-L1前脂肪细胞，PCR扩增PLIN1基因目的片段；sgRNA体外转录，Cas9体外酶切，鉴定sgRNA活性。<br>　　2.电穿孔转染3T3-L1前脂肪细胞，嘌呤霉素筛选转染成功的细胞；优化的“鸡尾酒”法，诱导3T3-L1前脂肪细胞分化；Westernblot检测脂肪细胞中PLIN1蛋白的表达，RT-PCR检测PLIN1mRNA相对表达量，检验阳性载体的敲除作用。<br>　　3.油红O染色脂肪细胞中脂滴，测量脂滴大小、读计脂滴数量；酶法测定脂肪细胞中甘油三酯和甘油含量，了解细胞脂解情况；Westernblot法检测细胞中脂解酶、Fsp27、PPARγ蛋白表达，RT-PCR检测细胞中HSL、ATGLmRNA相对表达量。<br>　　结果：<br>　　1.3个sgRNA均可以识别PLIN1基因靶点，发挥作用，体外酶切活性检测均有效；3个敲除载体的DNA测序结果均与预期一致。<br>　　2.各组质粒纯度均介于1.8-2.0，浓度在1.5μg/μL左右；电转染后细胞存活率80%，嘌呤霉素4d杀死细胞的最低浓度是4μg/ml，嘌呤霉素筛选后细胞存活率为30%；完成敲除后，3个阳性敲除组细胞中PLIN1蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），PLIN1mRNA相对表达量均明显降低。<br>　　3.诱导分化完成后，脂肪细胞中脂滴体积增大，在细胞核周围形成明显的“戒环样”结构；与对照组相比，PLIN1基因敲除组中大脂滴数量减少，小脂滴分布广泛，脂滴融合速度减慢；PLIN1基因敲除组细胞中甘油三脂含量（0.0310±0.0053mmol/gprotein）与对照组相比（空白对照组：0.1078±0.0039mmol/gprotein，阴性对照组：0.1256±0.0076mmol/gprotein）明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；PLIN1基因敲除组细胞中甘油含量（0.0984±0.0076mmol/gprotein）与对照组相比（空白对照组：0.0485±0.0131mmol/gprotein，阴性对照组：0.0376±0.0124mmol/gprotein）升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比，PLIN1基因敲除组细胞中HSL、ATGL蛋白表达量与mRNA相对表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组与PLIN1基因敲除组细胞中Fsp27、PPARγ蛋白表达量没有明显差异。<br>　　结论：<br>　　1.成功构建3个PLIN1基因敲除载体，体外酶切活性检测均有效。<br>　　2.3个PLIN1基因敲除载体均成功敲除3T3-L1前脂肪细胞中PLIN1基因。<br>　　3.脂肪细胞中PLIN1基因敲除后，细胞脂解速度加快。<br>　　4.脂滴表面失去PLIN1蛋白的屏障作用，而脂滴融合速度减慢，小脂滴数量增多，导致脂滴表面积增加，同时脂肪细胞中ATGL、HSL的蛋白表达增加等因素共同作用，导致脂肪细胞脂解速度加快。