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摘要目的：<br>　　CRISPR/Cas9是目前运用最广泛以RNA为引导的基因编辑系统，具有核酸内切酶功能。与其类似的Ago2蛋白在5’磷酸化或羟基化修饰的gDNA引导下也具有核酸内切酶功能。然而Ago蛋白仅在高温发挥作用这一特点限制了其在哺乳动物中的运用。最近有新的报道表明Ago蛋白家族中的NgAgo蛋白在37℃可能降解RNA。本研究旨在探讨NgAgo-gDNA基因编辑技术在体外和细胞实验中的编辑能力，并鉴定其新的切割位点。<br>　　方法：<br>　　1.体外切割实验：采用双酶切的方法构建pET-24a(+)-NgAgo原核表达质粒，转化入大肠杆菌菌株中进行表达。通过IPTG诱导pET-24a(+)-NgAgo阳性菌株的表达，并纯化NgAgo蛋白；设计与被切割靶标RNA反向互补并以5’端磷酸化或羟基化修饰的gDNA；用体外转录的方式合成靶标RNA：GFP-RNA、HCV-RNA1和HCV-RNA2；设计切割反应，在体外进行NgAgo-gDNA切割靶标RNA的实验。收集并纯化切割体系中的总RNA，将总RNA逆转录成cDNA后进行PCR，将PCR产物进行测序，验证NgAgo-gDNA的切割位点。<br>　　2.细胞内切割实验：构建pcDNA3.1-NLS-NgAgo真核表达质粒，设计与被切割靶标RNA反向互补并以5’端磷酸化或羟基化修饰的gDNA。将pcDNA3.1-NLS-NgAgo和相应gDNA共同转染入MCF-7/GFP细胞或5-8F/AKR1B10细胞中，观察相应靶标mRNA和蛋白质水平的变化情况。<br>　　3.统计学分析：统计学分析采用GraphPadPrism7.00统计软件。计量资料以-x±s表示。两组比较采用t检验；多组比较采用One-wayANOVA。P<0.05表示差异有统计学意义。<br>　　结果：<br>　　1.当同时加入NgAgo和相应gDNA时靶标RNA下面出现了两条比原带小的切割条带，随着切割时间的延长原带越来越弱，切割条带越来越明显，直到原带完全消失。推测这两条切割条带可能是NgAgo-gDNA切割出来的条带。测序结果显示RNA断裂的位点位于gDNA的5’端的第一个碱基。<br>　　2.与对照组相比，同时转染pcDNA3.1-NLS-NgAgo和gDNA组的靶标mRNA水平表达降低，同时蛋白质水平表达降低。<br>　　结论：<br>　　1.NgAgo是以5’端磷酸化或5’端羟基化依赖的方式作用RNA而不是DNA。<br>　　2.NgAgo-gDNA切割靶标RNA的断裂位点位于gDNA5’端的第一个碱基。