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BALB/c小鼠Graves病伴Graves眼病模型构建及新疗法的探索

摘要目的:构建BALB/c小鼠Graves病(Graves disease,GD)伴Graves眼病(Graves Ophthalmopathy,GO)的模型,探索TSHR特异性siRNA及细胞间黏附分子-1单抗对GD伴GO动物模型的疗效评价。<br>  方法:<br>  1、GD伴GO动物模型制备:使用重组质粒pcDNA3.1/TSHR289,在BALB/c小鼠腓肠肌部位注射并立即在注射部位电穿孔以增强转染免疫效果。每3周用此法进行一次免疫,共免疫4次。检测小鼠甲状腺素(thyroxine, T4)、促甲状腺素(thyroid stimulating hormone,TSH)、促甲状腺素受体刺激性抗体(Thyrotropin receptor stimulating antibody, TSAb )、促甲状腺素受体阻断性抗体(Thyrotropin receptor stimulating blocking antibody, TSBAb),对小鼠行99mTcO4-显像及甲状腺、眼球等组织的病理学分析,构建GD伴GO小鼠动物模型。<br>  2、对构建成功的GD伴GO小鼠动物模型使用siRNA及细胞间黏附分子-1单抗进行实验性治疗:以TSHR作为靶点筛选并设计合成siRNA,转染Nthy-ori-3-1细胞,通过蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测细胞中的TSHR转染前后表达水平差异,将siRNA及抗ICAM-1单克隆抗体腹腔注射于模型小鼠体内,检测小鼠T4、TSH、TSAb、TSBAb,行99mTcO4-显像及甲状腺、眼球等组织的病理学分析,观察siRNA及抗ICAM-1单克隆抗体对模型小鼠的疗效。<br>  结果:<br>  (1)在BALB/c小鼠腓肠肌使用重组质粒pcDNA3.1/TSHR289注射并进行电穿孔转染免疫的方式可获得较为满意的BALB/c小鼠GD伴GO动物模型,造模成功率接近80%。造模成功的实验组小鼠血清T4由免疫前的12.74±4.14ng/mL升高至70.84±16.46ng/mL,TSAb从免疫前的3.11±1.32μIU/mL上升至483.48±44.29μIU/mL,TSBAb从免疫前的4.24±1.10μIU/mL上升至16.81±6.05μIU/mL,均明显升高且明显高于对照组和空白组(P<0.05);造模成功的实验组小鼠血清TSH明显下降,从免疫前的2.63±0.55μIU/ml下降至免疫后的0.05±0.02μIU/ml(P<0.05),且明显低于对照组及空白组(P<0.05)。免疫后实验组小鼠体重增长速度较对照组及空白组明显缓慢。造模成功的实验组小鼠甲状腺组织肉眼观较其余两组饱满,甲状腺99mTcO4-摄取能力明显高于对照组和空白组。HE染色结果中甲状腺组织标本可见甲状腺滤泡胶质相对减少,淋巴细胞浸润,部分有不含胶质的空腔及滤泡细胞增生;心脏组织偶可见右心外膜下钙盐灶。造模成功的实验组小鼠肉眼可见眼球较对照组及空白组突出,但直径较其余两组未见明显差异,HE染色示眼外肌和球后组织淋巴细胞浸润、脂肪细胞浸润,偶可见眼外肌增粗。<br>  (2)Westernblotting结果显示,转染siRNA后的Nthy-ori-3-1细胞中的TSHR表达明显下降,使用siRNA及抗ICAM-1单克隆抗体进行实验性治疗的各组小鼠血清T4、TSAb、TSBAb均较治疗前明显下降,且明显低于未治疗的对照组,但仍高于未造模的空白组;TSH较治疗前明显上升,且明显高于未治疗的对照组,但仍低于未造模的空白组。治疗后小鼠体重低于空白组,但略高于对照组。治疗后小鼠甲状腺99mTcO4-摄取能力较未治疗的对照组有所下降,但仍略高于未造模的空白组,病理学与未治疗小鼠相比未见明显区别。治疗后小鼠眼球直径无明显变化,与对照组相比无明显病理学改变。<br>  结论:将重组质粒pcDNA3.1/TSHR289注射于BALB/c小鼠腓肠肌部位并在注射部位进行电穿孔的方式可获得较为满意的BALB/c小鼠GD伴GO动物模型,siRNA及抗ICAM-1单克隆抗体对GD伴GO模型小鼠有一定的治疗效果。

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