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摘要目的：<br>　　关节软骨缺损修复一直是临床治疗的难题，已有研究表明kartogenin(KGN)能够有效促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，进而修复软骨缺损。本实验旨在构建一种基于软骨细胞外基质(CECM)的能够缓释KGN的复合支架，将KGN的促进作用与CECM多孔支架的优势性能结合起来，达到既能缓释KGN，延长其作用时间，又能维持支架内部细胞保持较高活性的目的，为KGN的应用提供新的思路和方向。<br>　　方法：<br>　　1.采用乳化法制备PLGA微球，采用超声法制备PLGA纳米球，通过扫描电镜(SEM)或透射电镜(TEM)观察微球或纳米球的形态，通过Nanozs90观察粒径尺寸分布。采用高效液相色谱法测定KGN浓度，对比两种粒子负载KGN的载药量和包封率，筛选出PLGA微球进行后续实验。将猪膝关节软骨进行脱脂、脱细胞等处理提取CECM，配制成3%匀浆后与适量PLGA微球充分混匀，采用冷冻干燥法制备PLGA(KGN)/CECM复合支架。为了验证此支架对KGN的缓释效果，制备KNG与CECM匀浆直接复合的支架作为对照组，对比两种支架缓释KGN的效果差异。将KGN/CECM与PLGA(KGN)/CECM这两种负载KGN的支架分别浸泡于在PBS中，置于37℃摇床中匀速晃动，在特定时间点取浸泡液用高效液相色谱仪测定KGN的释放量，并绘制释放曲线。<br>　　2.提取原代兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)，培养至第三代(P3)备用。制备四种支架材料：单纯CECM支架(CECM)，负载KGN的PLGA微球/CECM复合支架(PLGA(KGN)/CECM)，CECM吸附TGF-β3支架(TGF-β3/CECM)，负载KGN的PLGA微球/CECM复合支架再吸附TGF-β3(PLGA(KGN)/CECM+TGF-β3)。将P3代BMSCs制备成高浓度的细胞悬液后接种至四组支架中，48小时后进行细胞粘附实验；分别在1、7天进行Live/Dead细胞活性检测；在1、3、5、7天进行CCK-8细胞增殖检测。进一步将细胞-支架复合体置于软骨诱导培养基中培养14和28天，培养结束后进行组织学染色以及II型胶原蛋白(COLⅡ)和聚蛋白多糖GAG的定量检测，分析体外环境下不同支架诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的效果差异。<br>　　3.选取24只四月龄雌性新西兰大白兔，每组3只(n=3)，在双侧膝关节滑车沟处制备全层软骨缺损和微骨折，缺损直径4.5mm，深达软骨全层，然后植入四种不同支架。术后继续饲养4周和12周，取材后进行大体观察和组织学染色，并进行COLII和GAG的免疫蛋白印迹(Western Blot)检测，比较各组间软骨缺损区修复情况的差异。<br>　　结果：<br>　　1、PLGA微球具有良好的球体形态，平均直径为2.18μm。PLGA纳米球形态规则，平均直径为288nm。PLGA微球对KGN的包封率和载药量分别为78.97+1.95和5.55+1.69(均值+标准差)，PLGA纳米球的分别为9.47+2.3和0.42+0.28(均值+标准差)。鉴于PLGA微球相对于纳米球对于KGN具有更高的载药量和包封率，因此选用PLGA微球进行后续实验。将PLGA微球与CECM制成复合支架后在扫描电镜下观察到：支架具有良好的孔隙结构，孔隙间彼此贯通，孔径集中分布在120-160μm之间。两种支架的KGN缓释曲线显示，添加PLGA微球的支架能够对KGN更好的缓释，减少了前期突释，延长了KGN释放时间。<br>　　2、细胞粘附实验，CCK-8增殖实验和Live/Dead染色结果均显示本实验制备的PLGA(KGN)/CECM复合支架对兔BMSC具有良好的细胞相容性。细胞-支架复合体体外诱导的组织学染色和蛋白定量分析结果显示，此复合支架与另外两个加药支架(TGF-β3/CECM，PLGA(KGN)/CECM+TGF-β3)均能促进骨髓间充质干细胞增殖并向软骨细胞分化，并且三组支架的促进作用无统计学差异。<br>　　3、实验动物术后饲养4W和12W后取材的大体观显示，本实验制备的PLGA(KGN)/CECM复合支架与另外两个加药支架均能促进软骨缺损区生成软骨样组织，组织学染色以及WesternBlot检测结果显示，大体观中各组新生的软骨样组织均含有软骨基质成分，并且新生物中II型胶原和GAG含量无明显差异。<br>　　结论：<br>　　1、PLGA(KGN)/CECM复合支架不仅能有效缓释KGN，并且能够维持支架中的细胞具有较高活性，促进间充质干细胞增殖并向软骨细胞分化，进而修复软骨缺损。<br>　　2、PLGA(KGN)/CECM复合支架在体内环境下具有良好的生物相容性，并且能够有效促进体内关节软骨缺损区的再生修复，可以作为良好的支架材料应用于软骨组织工程中。<br>　　3、TGF-β3与KGN的促软骨再生效果无明显差异，且两者无协同作用，KGN单独应用于软骨组织工程即可取得良好的效果。