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黑皮鸡枞菌菌丝体多糖的结构表征及慢性肝损伤修复研究

摘要黑皮鸡枞菌(Oudemansiella radicata)多糖具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等活性,但其对四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)诱导的小鼠慢性肝损伤的保护效应及其作用机制研究较少。本课题利用单因素试验和响应面分析(Response surface methodology, RSM)优化黑皮鸡枞菌菌丝体多糖(Mycelia polysaccharides of O. radicata,MPO)的提取条件,热水浸提法和醇沉法获得MPO,分离纯化得到MPO-W,对其进行结构和体外抗氧化能力测定,并利用 CCl4诱导的慢性肝损伤小鼠模型,初步探索 MPO-W的肝损伤修复机制,为寻找和发现天然保肝护肝药物提供理论参考。主要研究结果如下:<br>  (1)MPO的提取条件优化。最优提取条件为提取温度90℃、提取时间3.37h、加水体积27.93mL和pH6.96,理论得率为1.64%。考虑操作方便,提取条件设定为提取温度90℃、提取时间3.5h、加水体积30mL和pH7,MPO的理论得率为1.62%,实际得率为1.67±0.14%。<br>  (2)MPO的分离纯化。脱色素和去蛋白后的MPO通过DEAE-52纤维素离子交换层析和Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析进一步分离纯化,获得主要组分MPO-W,且其纯度达到91.73±2.63%。<br>  (3)MPO-W的物理化学性质及结构测定。物理化学性质显示,MPO-W是一种浅土黄色粉末状物质,不溶于大多数有机溶剂,热稳定性好,且膨胀度、保水能力和持油能力分别是134.81±3.93%、4.55±0.29%和2.38±0.05%。气质联用( Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)和高效凝胶渗透色谱(High-performance gel-permeation chromatography,HPGPC)分析表明,MPO-W的分子量为1.30×105Da,主要由岩藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖构成,摩尔比为8.67∶37.89∶35.98∶16.60。根据傅里叶变换红外光谱(Fourier transform-infrared spectroscopy,FT-IR)、甲基化分析、核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)结果表明,MPO-W主要由Manp-(1→、→3)-Fucp-(1→、→2)-Manp-(1→、→4)-Glcp-(1→、→6)-Galp-(1→和→2,6)-Manp-(1→六种糖残基组成,且具有α和β构型的吡喃糖。扫描电镜及刚果红试验结果显示,MPO-W分子间作用力大,结构紧密,且不具有三维螺旋空间构象。<br>  (4)MPO-W的体外抗氧化能力测定。MPO-W对羟基、超氧阴离子和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基具有一定的清除能力,且还原力较强。<br>  (5)MPO-W对CCl4诱导小鼠慢性肝损伤的修复作用。①对于CCl4代谢酶,MPO-W能较好地改善肝组织中细胞色素 P4502E(Cytochrome P4502E1,CYP2E1)的活性和mRNA表达。②对于肝损伤程度,慢性肝损伤小鼠血清中肝损伤标志酶的活性明显被MPO-W抑制,且小鼠肝组织病理学切片也显示MPO-W的干预能够减轻肝损伤程度。③对于肝脂和血脂代谢紊乱,MPO-W可有效地调控慢性肝损伤小鼠肝组织中腺苷酸活化蛋白激酶-α(Adenosine monophosphate activated protein kinase-α,AMPKα)和甾醇调节元件结合蛋白-1c(Sterol regulatory element binding proteins-1c,SREBP-1c)减少TC和TG堆积,也改善了血脂代谢紊乱。④对于体内抗氧化能力,MPO-W明显提升慢性肝损伤小鼠肝组织中总抗氧化能力(Total antioxidant capability,T-AOC)及抗氧化酶活性,并降低丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和脂质过氧化物(Lipid peroxide,LPO)含量;抗氧化相关蛋白和荧光探针DHE标记的ROS分析表明,MPO-W显著上调血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)和红系衍生的核因子2相关因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor2,Nrf2)的蛋白和mRNA表达,降低细胞中ROS水平,进一步证明MPO-W具有较好的抗氧化活性。⑤对于抗纤维化能力,MPO-W明显下调转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1,TGFβ1)的蛋白和mRNA表达,从而抑制肝星状细胞活化;马森(Masson)和天狼猩红(Sirius red)染色及羟脯氨酸(Hydroxyproline, Hyp)分析结果也支持 MPO-W的抗纤维化作用。⑥对于炎症反应,MPO-W有效地遏制 IκB激酶(IκB kinase,IKK)和核转录因子p65(Nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)磷酸化及核因子κB抑制蛋白-α(Inhibitor of NF-κB-α,IκBα)降解,阻止NF-κB激活,减少炎症因子分泌,从而达到抗炎症目的。⑦对于细胞凋亡,MPO-W显著上调抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2),下调促凋亡蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3),且Tunel法荧光标记的凋亡细胞数也说明MPO-W具有抑制细胞凋亡作用。⑧对于细胞自噬,MPO-W明显降低自噬相关蛋白-5(Autophagy-related protein-5,ATG5)、ATG7的蛋白表达及微管相关蛋白-Ⅱ(Microtubule associated protein1A/1B-light chain3-Ⅱ,LC3-Ⅱ/LC3-I)的比值,表明MPO-W具有缓解细胞自噬的能力。体内试验结果说明,MPO-W能够通过调控抗氧化、纤维化、炎症、细胞凋亡、细胞自噬中相关分子机制,修复 CCl4诱导的慢性肝损伤。

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