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摘要肿瘤复杂的免疫抑制微环境是导致其治疗失败及复发转移的重要原因。骨髓来源的抑制性细胞（circulating myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、肿瘤相关性巨噬细胞（tumor-associated macrophages，M2-TAMs）、调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）为肿瘤免疫抑制微环境的主力军，这三者可在肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中形成免疫抑制“铁三角”抑制机体的免疫反应，促进肿瘤的生长及转移。为了增强肿瘤免疫治疗的效果，迫切需要在抑制肿瘤细胞生长的同时重塑TME减少免疫抑制细胞的数目以高效激活机体免疫应答协同杀伤肿瘤细胞。基于此，本课题构建了一种用于增强免疫治疗的肿瘤微环境响应型纳米递药系统GW3965@PAE-PEG-PEP（GW@PPP）。利用研究广泛的pH-敏感材料聚β-氨基酯（polyβ-amino esters，PAE）与聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）通过可自组装形成的纳米粒为载体，递送LXR激动剂GW3965促进脂代谢蛋白（apolipoprotein E，ApoE）转录消耗MDSCs及Tregs。纳米粒同时通过硫醇反应加载具有酶敏感的M2-TAMs靶向凋亡肽（targeting apoptotic peptide，PEP）用于杀伤M2-TAMs以达到高效激活机体免疫应答，抑制肿瘤的生长。<br>　　该系统具有以下特征：（1）纳米粒在M2-TAMs靶向凋亡肽（PEP）的引领下靶向于肿瘤组织；（2）纳米粒响应于肿瘤微环境的基质金属蛋白酶（metalloproteinase，MMP）和pH崩解释放出GW3965和PEP；（3）GW3965可作用于肿瘤微环境中的多类细胞增强ApoE的转录，消耗肿瘤细胞、MDSCs及Tregs。断裂的PEP靶向于M2-TAMs型巨噬细胞通过线粒体途径促进其凋亡；因此，GW@PPP可通过消耗肿瘤细胞及TME中的免疫抑制细胞以高效激活机体免疫应答而增强抗肿瘤活性。课题研究的具体内容与结果如下：<br>　　1.首先，合成具有TME双重响应的纳米粒GW@PPP。将聚乙二醇-马来酰亚胺（OH-PEG-Mal2000）丙烯酸酯化后与1,6-二醇二丙烯酸酯（HDD）、4,4'-三甲基二哌啶（TDP）通过1,4-迈克尔加成反应合成具有pH敏感的聚合物嵌段PAE-PEG-Mal。核磁共振图谱结果证明各阶段产物均可成功制备。通过薄膜分散法制备基础纳米粒GW3965@PAE-PEG（GW@PP），GW3965位于纳米粒的脂溶性内核中。M2型巨噬细胞靶向凋亡肽（PEP）通过硫醇反应加载于基础纳米粒上得到GW@PPP。纳米粒度分析仪结果显示GW3965@PPP粒径分布在88.7±1.26nm，而在pH为6.4的条件下纳米粒崩解，表明该纳米粒具有较好的肿瘤微环境pH响应性能。此外，体外释药实验也表明该纳米粒具有良好的弱酸和酶响应控释性能，可防止药物在到达肿瘤部位前发生泄漏。<br>　　2.体外实验中，以黑色素瘤B16F10细胞、骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为模型细胞评估GW@PPP的体外抗肿瘤效果。细胞毒性实验表明，GW3965和多肽PEP分别有效的抑制了B16F10细胞和M2型巨噬细胞的生长。靶向实验结果显示M2型巨噬细胞在1h摄取PEP的量是M1型巨噬细胞1.6倍，表明PEP具有良好的M2型巨噬细胞靶向能力。细胞凋亡实验和线粒体膜电位检测结果显示GW@PPP可通过线粒体途径可诱导62.3±2.3%的M2型巨噬细胞凋亡。划痕和Transwell等实验结果验证了GW@PP的体外抗肿瘤转移及侵袭的能力。血管生成实验结果表明GW@PP可抑制50.3±1.8%的体外血管生成。综上所述，制备的GW@PPP给药系统可有效抑制黑色素瘤细胞的增殖、侵袭及迁移，具有显著的体外抗肿瘤活性。<br>　　3.体内实验中，以C57BL/6小黑鼠为动物模型，通过考察GW@PPP给药系统在小鼠体内的分布情况、肿瘤体积变化、免疫荧光实验和肿瘤部位细胞的流式实验等结果用以综合评价GW@PPP的药效学和病理学特征。小鼠的活体成像结果显示给药2h后，IR780@PPP组肿瘤部位的荧光信号强度明显高于IR780@PP组，说明了M2-TAMs型巨噬细胞靶向肽具有良好的肿瘤靶向作用。体内药效学中，GW@PPP组的瘤体积相比生理盐水组有明显下降的趋势，这说明该纳米给药系统具有良好的生物安全性。动物流式实验显示GW@PPP组相比生理盐水组，MDSCs降低了71.6±1.3%，M2-TAMs降低了42.2±0.8%，Tregs降低了48.2±2.2%，CD8+T细胞增加了72.8±1.4%，这说明该纳米给药系统可通过损害肿瘤微环境免疫抑制细胞，解除肿瘤微环境的免疫抑制状态而引发强大的机体免疫，抑制肿瘤的生长。免疫荧光实验与流式实验结果保持一致。综上所述，GW@PPP载药系统可将药物靶向递送至肿瘤部位，通过解除TME免疫抑制引发机体强烈的抗肿瘤免疫应答，从而抑制黑色素瘤的生长和转移。<br>　　综上所述，该课题所制备的pH和酶双敏感纳米粒GW@PPP可高效富集于肿瘤部位，通过抑制肿瘤细胞及MDSCs、M2-TAMs、Tregs免疫抑制细胞促进细胞毒性T细胞的浸润及促炎性细胞因子分泌以增强抗肿瘤效应。该课题为肿瘤的免疫治疗提供了一个新的思路，在肿瘤的免疫治疗中具有重要的应用前景。