检索历史 清除

摘要主要嗅觉表皮（main olfactory epithelium，MOE）是哺乳动物的主要嗅觉器官。腺苷酸环化酶3（adenylyl cyclase3,AC3）是主要嗅觉信号转导通路cAMP信号转导通路的重要成员之一。AC3缺失会影响嗅觉通路的表达。MOE暴露在外界环境中容易受到病原体的侵扰；在体内一些溶质的转运也会影响到MOE的功能。体内大多数溶质是由转运蛋白介导转运的，溶质载体(solute carriers,SLC)超家族是膜转运蛋白家族，在MOE中的溶质转运方面发挥重要作用。小鼠MOE中AC3缺失后是否会影响部分SLC家族成员的表达以及部分SLC家族成员表达发生改变后又会对MOE的功能产生怎样的影响呢？这些问题目前尚未得到解决。<br>　　为了解决以上问题，本文以野生型（AC3+/+）、敲除型(AC3-/-)和敲入型(hAC3)三种基因型小鼠MOE组织以及NIH3T3细胞为实验材料，利用qRT-PCR、Western blot、IF、Co-IP以及质谱等实验方法进行以下探究：<br>　　1、通过qRT-PCR实验初步在mRNA水平上对部分SLC家族成员的表达进行定量分析，发现：<br>　　（1）Slc8a1和Slc6a3在AC3-/-小鼠MOE中的表达量与AC3+/+相比显著下降，在hAC3小鼠MOE中的表达量与AC3+/+相比显著升高。<br>　　（2）Slc9a2、Slc15a3和Slc22a20在AC3-/-小鼠MOE中的表达量与AC3+/+相比显著上升，在hAC3小鼠MOE中的表达量与AC3+/+相比显著下降。说明在mRNA水平上AC3影响部分SLC家族成员的表达。<br>　　2、采用Western blot及IF实验对SLC8A1及SLC6A3进行蛋白定量及定位分析，发现：<br>　　（1）蛋白水平和组织水平上结果一致，发现SLC8A1和SLC6A3在AC3-/-小鼠MOE中的表达量与AC3+/+相比显著下降，在hAC3小鼠MOE中的表达量与AC3+/+相比显著升高。<br>　　（2）定位分析表明AC3的表达不影响SLC8A1与SLC6A3的定位情况。SLC8A1主要分布在纤毛层、与纤毛层标记蛋白AC3共定位，另外SLC8A1在细胞体、树突及嗅小泡中也有分布。SLC6A3主要分布在纤毛层及支持细胞，与支持细胞标记蛋白Ck18共定位。<br>　　上述结果说明AC3能够调控SLC8A1和SLC6A3的表达。<br>　　3、采用Co-IP以及质谱实验对SLC8A1及SLC6A3相互作用蛋白进行分析发现，SLC8A1及SLC6A3相互作用蛋白参与多条信号通路的表达。其中与我们研究相关的有cAMP嗅觉信号通路以及凋亡信号通路。通过实验，我们验证了SLC8A1与抗凋亡蛋白HSP90AA1相互作用。这说明在MOE中SLC8A1的表达可能对MOE的凋亡有影响。<br>　　4、在NIH3T3细胞中利用Co-IP及Western blot实验证明SLC8A1与HSP90AA1相互作用，并且通过RNAi的方法敲低SLC8A1表达后，Caspase3表达增加，也就是说SLC8A1表达降低后凋亡增加。这说明SLC8A1与HSP90AA1相互作用调控细胞的凋亡。