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摘要目的：<br>　　本研究旨在探讨lncRNA DLEU2在食管鳞癌生长转移中的生物学功能，探究lncRNA DLEU2是否发挥ceRNA模式参与食管鳞癌发生发展，进一步分析其作用机制，为发展食管鳞癌新的治疗策略提供新的靶点和理论依据。<br>　　方法：<br>　　（1）lncRNA DLEU2在食管癌中的表达及预后意义<br>　　1）本研究通过生物信息学在线分析网站Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA）分析lncRNA DLEU2在食管癌组织和正常组织中的表达情况及其表达与食管癌患者预后的关系。<br>　　2）采用荧光定量PCR检测lncRNA DLEU2在食管鳞癌细胞系Eca-109和KYSE-150以及人正常食管上皮细胞HEEC中的表达水平。<br>　　（2）lncRNA DLEU2在食管鳞癌生长转移中的生物学作用<br>　　1）食管鳞癌细胞系Eca-109和KYSE-150分别转染siRNA-DLEU2及其阴性对照si-NC，采用荧光定量PCR检测lncRNA DLEU2表达，验证敲低效率。<br>　　2）细胞转染后，分别采用CCK8、克隆形成、细胞划痕实验、Transwell和流式细胞术实验检测敲低lncRNA DLEU2对Eca-109和KYSE-150细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡能力的影响；采用western blot实验检测敲低lncRNA DLEU2对凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、cleaved Caspase3和active Caspase9）以及Akt信号通路关键组分蛋白（Akt、p-Akt及Cyclin D1）表达水平的影响。<br>　　（3）lncRNA DLEU2的ceRNA模式探究<br>　　1）采用生物信息学预测网站（Starbase）筛选与lncRNA DLEU2具有可能相互结合位点的miRNA即miR-30e-5p；通过双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA DLEU2是否与miR-30e-5p结合。<br>　　2）采用生物信息学预测网站（TargetScan）筛选与能够与miR-30e-5p结合的靶基因即E2F7；构建双荧光报告基因载体，通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-30e-5p是否与E2F7结合；采用western blot实验检测miR-30e-5p、miR-30e-5p+pcDNA3.1-DLEU2对E2F7蛋白表达水平的影响，验证lncRNA DLEU2/miR-30e-5p/E2F7三者间的相互作用。<br>　　（4）E2F7在食管鳞癌发生发展中的生物学作用<br>　　1）通过生物信息学在线分析网站GEPIA分析E2F7在食管癌组织和正常组织中的表达情况及其表达与食管癌患者预后的关系；采用荧光定量PCR检测E2F7在食管鳞癌细胞系Eca-109和KYSE-150以及人正常食管上皮细胞HEEC中的表达水平。<br>　　2）食管癌细胞系Eca-109和KYSE-150分别转染siRNA-E2F7及其阴性对照si-NC，分别采用荧光定量PCR、western blot检测E2F7mRNA和蛋白表达量，验证敲低效率。<br>　　3）细胞转染后，采用CCK8、克隆形成实验检测敲低E2F7对Eca-109和KYSE-150细胞增殖能力的影响；采用细胞划痕实验、Transwell实验分别检测敲低E2F7对Eca-109和KYSE-150细胞迁移、侵袭的影响；采用流式细胞术检测敲低E2F7对Eca-109和KYSE-150细胞凋亡的影响；采用western blot实验检测敲低E2F7对凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、cleaved Caspase3和active Caspase9）以及Akt信号通路关键组分蛋白（Akt、p-Akt及Cyclin D1）表达水平的影响。<br>　　（5）回补实验进一步验证lncRNA DLEU2/miR-30e-5p/E2F7的关系<br>　　Eca-109和KYSE-150细胞均分为四组，分别转染siRNA-DELU2、siRNA-DELU2+miR-30e-5p抑制剂、siRNA-DELU2+pcDNA3.1-E2F7，其中转染空载体的一组细胞为阴性对照组。细胞转染后，采用western blot实验检测各组细胞中E2F7的表达；采用CCK8、克隆形成实验检测各组细胞增殖情况；采用细胞划痕实验、Transwell实验分别检测各组细胞迁移、侵袭情况。<br>　　（6）统计学方法<br>　　本研究中所有实验均为三次独立重复实验，实验数据以mean±SD表示，使用GraphPad Prism7.0软件进行分析。采用Student’s t检验或单因素ANOVA检验对各组间的差异进行统计学分析，P值小于0.05被认为具有统计学意义。<br>　　结果：<br>　　（1）lncRNA DLEU2在食管癌中的表达及预后意义<br>　　通过GEPIA数据库发现，lncRNA DLEU2在食管癌组织中表达水平显著升高，其表达水平与食管癌患者的预后相关，且lncRNA DLEU2的表达水平高的患者预后较差。RT-PCR结果显示，lncRNA DLEU2在Eca-109和KYSE-150细胞中的表达水平均显著高于HEEC细胞。<br>　　（2）lncRNA DLEU2在食管鳞癌生长转移中的生物学作用<br>　　1）RT-PCR结果显示si-DLEU2显著抑制lncRNA DLEU2在Eca-109和KYSE-150细胞中的表达，敲低细胞构建成功。<br>　　2）敲低lncRNA DLEU2表达可显著抑制Eca-109和KYSE-150细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。敲低lncRNA DLEU2表达能够显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进促凋亡蛋白Bax的表达，且裂解的Caspase3和活化的Caspase9的表达水平也显著被si-DLEU2上调。另外，敲低lncRNA DLEU2还通过抑制Akt的磷酸化水平抑制Akt信号通路的活化，且Akt的下游靶蛋白Cyclin D1的表达水平也随着lncRNA DLEU2的下调而降低。<br>　　（3）lncRNA DLEU2的ceRNA模式探究<br>　　1）通过生物信息学在线分析工具Starbase发现miR-30e-5p具有能够与lncRNA DLEU2结合的潜在位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示，双荧光素酶报告基因实验结果证实lncRNA DLEU2能够结合miR-30e-5p。<br>　　2）通过生物信息学在线工具TargetScan发现，E2F7含有可能与miR-30e-5p相互作用的结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果证实E2F7是miR-30e-5p的靶基因。Western blot实验结果表明，miR-30e-5p表达上调能够显著抑制E2F7的蛋白表达水平，而miR-30e-5p对E2F7的抑制作用能被lncRNA DLEU2上调解除，证实lncRNA DLEU2可通过竞争性结合miR-30e-5p正调控E2F7的表达。<br>　　（4）E2F7在食管鳞癌发生发展中的生物学作用<br>　　1）通过GEPIA数据库，发现E2F7mRNA在食管癌组织中的表达水平显著高于正常组织，其高表达与患者预后不良有关。RT-PCR结果表明，E2F7mRNA在食管癌细胞Eca-109和KYSE-150中的表达水平均显著高于正常食管上皮细胞HEEC。<br>　　2）通过siRNA-E2F7转染敲低E2F7表达可显著抑制Eca-109和KYSE-150细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。敲低E2F7表达能够显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进促凋亡蛋白Bax的表达，且裂解的Caspase3和活化的Caspase9的表达水平也显著被si-E2F7上调。另外，敲低E2F7还通过抑制Akt的磷酸化水平抑制Akt信号通路的活化，且Akt的下游靶蛋白Cyclin D1的表达水平也被si-E2F7抑制。<br>　　（5）回补实验进一步验证lncRNA DLEU2/miR-30e-5p/E2F7的关系<br>　　Western blot结果显示，与单独转染si-DLEU2细胞相比，由si-DLEU2引起的E2F7表达水平的降低能够被miR-30e-5p抑制剂回补。细胞功能实验结果显示，与单独转染si-DLEU2细胞相比，si-DLEU2对Eca-109和KYSE-150细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用能够被miR-30e-5p抑制剂或E2F7过表达解除。<br>　　结论：<br>　　本研究表明lncRNA DLEU2在食管癌中表达上调，其高表达与患者预后不良相关；lncRNA DLEU2作为一个ceRNA通过竞争性结合miR-30e-5p调控E2F7表达，影响食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭，发挥促癌基因功能；E2F7在食管鳞癌的生长转移中同样作为肿瘤促进子发挥作用。lncRNA DLEU2可以用作预测食管鳞癌患者进展和预后的潜在生物标志物，并且可以是抗肿瘤治疗的有效靶点。