摘要本研究分为4个部分:<br> 1)Resistin在KOA患者及健康对照人群血清和关节液中的表达特点和临床相关性分析;<br> 2)CAP1在KOA软骨组织中表达特点及与resistin表达的相关性分析;<br> 3)Resistin对KOA软骨细胞刺激效应及CAP1在其中的作用研究;<br> 4) p38-MAPK和NF-κB信号通路在Resistin-CAP1调控软骨细胞释放炎性趋化因子和基质降解酶中的作用研究;<br> 第一部分:Resistin在KOA患者及健康对照人群血清和关节液中的表达特点和临床相关性分析<br> 目的:了解resistin在KOA患者及健康对照人群血清和关节液中的表达特点,并分析其临床相关性。<br> 方法:该研究选取纳入受试对象时间段为2017年5月-2018年6月。在我院骨关节外科纳入103例因KOA行初次膝关节置换的患者,同时在我院健康体检中心纳入86例行常规年度体检无KOA症状人群。收集两组患者及对照人群相关临床资料、血清,及KOA患者的膝关节液。用ELISA法检测两组患者血清、膝关节液中resistin的浓度。比较两组患者人群的临床特征、血液及膝关节液中resistin水平,并分析其与临床特征的相关性特点。<br> 结果:(1)与健康对照组(Healthy Control,HC)相比,KOA组患者年龄较大(KOA vs. HC:63.67 vs.51.36, p<0.0001),更大的BMI及较高的空腹血糖水平(KOA vs. HC:5.54 vs.5.03, p<0.0001).两组患者在性别比例、甘油三酯、高密度脂蛋白水平无明显差别。<br> (2)KOA患者血清中resistin水平高于HC组,调整相应年龄、BMI、空腹血糖及甘油三酯后两组间差异消除(padj=0.688)。KOA患者血清 resistin水平显著高于其膝关节液水平( Serum vs. SF:8.26 vs.3.26, ng/ml, p<0.0001).<br> (3) KOA患者中,Kellgren-Lawrence(K-L)分期为Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期患者分别为18例、38例和47例。K-L分期Ⅳ期患者血清resistin表达水平显著高于Ⅱ期。KOA患者中,K-L分期为Ⅳ期患者关节液浓度高于Ⅱ期和Ⅲ期。<br> 结论:Resistin在KOA患者中血清中表达增高,而且局部膝关节液中resistin表达水平和KOA严重程度呈正相关性。提示resistin表达水平和KOA具有明显相关性。<br> 第二部分: CAP1在KOA软骨组织中表达特点及与resistin表达的相关性分析<br> 目的:研究CAP1在KOA患者关节软骨组织中的表达改变情况及其与resistin表达是否有相关性。<br> 方法:收集21例KOA患者及10例股骨颈骨折患者关节软骨组织。首先采用RT-PCR和Western blot蛋白印迹检测两组软骨组织中CAP1的mRNA和蛋白表达情况。然后用免疫组化技术检测两组患者软骨组织中CAP1及resistin蛋白的表达特点。并用ASI digital systems(powered by GenASIs?)软件进行两组免疫组化H-Score评分,分析其相关性。<br> 结果:纳入21例KOA患者(F/M,15/6)及10例股骨颈骨折患者(F/M,7/3),股骨颈骨折患者年龄较大(KOA vs FNF:63.14 vs76.40,p<0.0001)。与股骨颈骨折的软骨组织相比,在KOA患者软骨组织中,RT-PCR结果显示CAP1的mRNA表达明显增高,并且Western blot蛋白印迹显示CAP1蛋白表达也明显增高。免疫组化H-Score评分结果提示, KOA患者软骨组织中CAP1表达增高(KOA vs FNF:168.90 vs66.32,p<0.0001)、resistin表达也增高,CAP1与resistin表达具有明显正相关性(r=0.631,p=0.002)。<br> 结论:CAP1在KOA患者软骨组织中表达增高,且与resistin表达呈现正相关性。<br> 第三部分:Resistin对KOA软骨细胞刺激效应及CAP1在其中的作用研究<br> 目的:探索resistin对KOA软骨细胞的刺激效应及CAP1在其中的作用。<br> 方法:(1)随机选取9例KOA患者分成3组,取大体正常的软骨组织分离培养出软骨细胞。每组3例患者的软骨细胞混合培养。人软骨细胞分别与人重组resistin蛋白在浓度为0 ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml条件下,分别培养24 h、48 h和72 h。与未加resistin蛋白的软骨细胞对比,用CCK-8实验检测resistin对软骨细胞毒性的影响,同时用RT-PCR检测resistin浓度和培养时间对CAP1表达的影响。<br> (2)分别用人重组resistin蛋白500ng/ml按时间依赖性(24h、48h、72h)共培养刺激人软骨细胞。浓度依赖性来刺激实验中,用人重组resistin蛋白(250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)和人软骨细胞共培养48h。选取未加resistin作为实验对照。用RT-PCR检测resistin刺激后软骨细胞CCL3、CCL4、MMP-13、ADAMTS-4及表达情况。<br> 结果:(1)CCK-8实验结果表明,与未加resistin的对照组相比,24 h内任何浓度的resistin刺激未见显著的软骨细胞生长抑制;只有浓度为1000 ng/ml的resistin在刺激48 h和72 h才会对软骨细胞的生长产生显著抑制效果(48 h:p<0.01;72 h:p<0.001)。软骨细胞中CAP1表达只有在resistin浓度为1000 ng/ml刺激48小时(p<0.01)和72小时(p<0.01)才会显著升高。<br> (2)KOA软骨细胞resistin刺激后,时间依赖性结果表明:CCL3和MMP-13的mRNA表达水平随着时间逐渐增高,在48h达到峰值之后表达下降;CCL4和ADAMTS-4的mRNA表达增高且在24h立刻达到峰值,随即逐渐下降。Resistin刺激后浓度依赖性结果表明:CCL3的mRNA表达随着浓度增加逐渐增高,但是在浓度大于500ng/ml之后增加缓慢;CCL4和ADAMTS-4的mRNA表达水平随着resistin浓度增加而增加;MMP-13的mRNA表达在500ng/ml达到峰值,随后表达下降。<br> (3)免疫共沉淀结果提示在软骨细胞中CAP1可以与外源性resistin直接结合而发挥受体作用。<br> (4)腺病毒转染CAP1基因敲除后,RT-PCR和Western blot显示CAP1在软骨细胞中敲除效果大于90%。与Control-shRNA组软骨细胞相比,CAP1-shRNA组软骨细胞在人重组resistin蛋白刺激48h和72h后:RT-PCR显示软骨细胞CCL3、CCL4、MMP-13和ADAMTS-4的mRNA在48h和72h的表达明显降低;ELISA结果提示软骨细胞上清液中CCL4蛋白在48h和MMP-13蛋白在72h表达也明显降低。<br> 结论:高浓度的resistin可对软骨细胞产生细胞毒性抑制其生长。Resistin刺激KOA软骨细胞上调CCL3、CCL4、MMP-13和ADAMTS-4的表达而起到促炎症反应和促基质分解作用,CAP1作为与resistin直接结合的受体在其中起到关键作用。在软骨细胞中基因敲除CAP1的表达可显著降低resistin诱导的CCL3、CCL4、MMP-13和ADAMTS-4的表达。<br> 第四部分:p38-MAPK和NF-κB信号通路在resistin-CAP1调控软骨细胞释放炎性趋化因子和基质降解酶中的作用研究<br> 目的:探索p38-MAPK和NF-κB信号通路在resistin-CAP1调控KOA软骨细胞参与的炎症反应和基质降解中的作用。<br> 方法:取KOA软骨细胞培养,先分为五组:加resistin(500ng/ml)后30分钟组、60分钟组、6小时组、24小时组及未加resistin的空白对照组。在按CAP1是否敲除及是否加入resistin(500ng/ml)分四组:CAP1-shRNA组、CAP1-shRNA加resistin组、Control-shRNA组、Control-shRNA加resistin组。用Western blot技术检测p-38蛋白、磷酸化-p-38蛋白(phospho-p38)、p-65蛋白和磷酸化-p-65蛋白(phospho-p65)表达情况,来分析p38-MAPK和NF-κB信号通路在KOA软骨细胞resistin刺激后及CAP1在其中的作用。<br> 结果:Western blot结果显示,p38和p65在resistin刺激后未见明显变化,phospho-p38水平在resistin刺激后6h时升高并在24h时达到峰值,phospho-p65水平在resistin刺激后60分钟达到峰值之后略有下降。与 Control-shRNA组比较, CAP1敲除的CAP1-shRNA组,phospho-p38和phospho-p65蛋白表达水平显著降低,p38和p65蛋白表达水平也轻度降低。<br> 结论:Resistin-CAP1通过激活p38-MAPK和NF-κB信号通路调控软骨细胞参与KOA炎症反应和基质降解进程。
更多相关知识
- 浏览73
- 被引3
- 下载83
相似文献
- 中文期刊
- 外文期刊
- 学位论文
- 会议论文