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摘要基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）是一类锌离子依赖的肽链内切酶，可以引起炎症组织的破坏，是慢性炎症性疾病的标志物，而且能够降解基质膜和胶原，促进癌细胞的转移。但是当MMPs抑制剂类药物应用于癌症临床试验时会引起了很多副作用，这揭示了MMPs在炎症性疾病和癌症进程中具有新的生物学功能。<br>　　MMP-26（Matrix metalloproteinase-26，MMP-26，或者Matrilysin-2）是MMPs家族最小的成员，与其他MMPs家族成员相比，尽管在结构上具有高度的相似性，但因其具有独特的种属和组织表达特异性、独特的细胞内定位以及独特的自激活机制等等，使得MMP-26在细胞内行使与其他MMPs家族成员不同的功能。<br>　　内质网是真核细胞中重要的细胞器，是蛋白质合成、翻译后修饰、脂质合成、钙离子储存和维持钙离子稳态的重要场所。当内质网的功能和需求之间出现紊乱时会产生内质网压力，并启动内质网压力应激。许多生理和病理进程都伴随着内质网压力的产生，而内质网压力本身也可以导致和促进疾病的发生发展。<br>　　在实验室的前期工作中，发现MMP-26特异性地定位于细胞内质网中，这与之前的许多文献报道相一致，即本应分泌到细胞外的MMP-26主要表达于细胞质，在细胞外几乎检测不到。因此提出了疑问：当细胞内质网环境改变，产生内质网压力时，MMP-26是否仍然定位于内质网?MMP-26是否能够参与内质网应激进程?MMP-26在内质网压力下的定位及功能是否会影响组织的生理和疾病进程?这些疑问是本论文试图解释的问题。<br>　　在本研究中，利用内质网压力诱导剂处理MMP-26-GFP稳定表达细胞发现MMP-26-GFP在A23187（Ca2+离子载体）、TG（毒胡萝卜内酯，Thapsigargin）和DTT（二硫苏糖醇）刺激下向高尔基体转移，并且进一步向细胞外分泌。并且这种压力下的定位改变是与MMP-26的结构有关，与活性无关。采用亲和层析纯化的方法寻找MMP-26-GFP在内质网内相互作用的蛋白，在相互作用复合物中用免疫印迹的方法检测到了内质网分子伴侣GRP78，并且体外表达GST-GRP78证实了和MMP-26-GFP的相互作用。为了找到MMP-26和GRP78相互作用的基序，构建了MMP-26-GFP、MMP-26-catE209A-GFP（MMP-26催化结构域无活性突变体）和MMP-26?80-125-GFP（MMP-26删除了80-125位的氨基酸）等一系列的MMP-26删除或截短型突变体进行定位和相互作用的检测，结果显示片段80-125位氨基酸是MMP-26和GRP78相互作用的关键序列，并且进一步利用计算机模拟的方法分析了MMP-26与GRP78的相互作用。<br>　　MMP-26在内质网压力下的定位会发生改变，MMP-26的内质网定位是否会对内质网功能产生影响?Sang Qingxiang教授的研究表明：当利用siRNA转染的方式敲低MDA-MB-231细胞中MMP-26的表达水平时，GRP78蛋白水平增加。基于上述研究首先检测了GFP、MMP-26-GFP、shRNA-control和shRNA-MMP-26稳定表达细胞中的GRP78的蛋白水平，结果显示MMP-26-GFP表达细胞中的GRP78蛋白水平低于GFP表达细胞，shRNA-MMP-26表达细胞中的GRP78蛋白水平高于表达细胞shRNA-control。由于GRP78是内质网压力应激的重要调控分子，并且具有抗凋亡的功能。为了分析MMP-26调控GRP78的蛋白水平是否会影响细胞对内质网压力的敏感性，本文对GFP、MMP-26-GFP、shRNA-control和shRNA-MMP-26表达细胞，利用MTT、流式细胞计数和Hoechst33342染色的方式检测了在内质网压力诱导剂的刺激下细胞凋亡的数量，结果显示在内质网压力下MMP-26-GFP表达细胞的凋亡显著高于GFP表达细胞，shRNA-MMP-26表达细胞凋亡显著少于shRNA-control表达细胞。同时，利用MMP-26-GFP表达质粒瞬时转染HEK293T和HeLa细胞，结果显示细胞存活数量随着质粒浓度的增大逐渐减少。这些结果都表明MMP-26增加了细胞对于内质网压力的敏感性。进一步检测了内质网压力下的GRP78蛋白水平以及下游三个内质网压力感受器IRE1α、PERK和ATF-6的激活水平，结果显示IRE1α、PERK和ATF-6在长时间或者短时间的内质网压力下均被激活，并且MMP-26表达水平的增加减少了内质网压力下GRP78的蛋白水平，尽管对于压力下PERK和ATF-6的激活并没有显著影响，但增加了内质网压力下IRE1α的磷酸化水平，上述结果进一步证实MMP-26增加了细胞对内质网压力的敏感性。<br>　　为了进一步阐明MMP-26的活性是否是影响细胞对内质网压力敏感性的重要因素，构建了MMP-26的无活性突变体MMP-26-catE209A-GFP和MMP-26-wtE209A-GFP稳定表达细胞，并且检测了在长时间或者短时间的内质网压力下细胞对内质网压力的敏感性。结果显示不具有活性的突变体表达细胞不改变内质网下的敏感性。GRP78的蛋白水平在MMP-26wtE209A-GFP表达细胞中显著高于MMP-26-GFP表达细胞，表明MMP-26影响GRP78的蛋白水平是依赖其活性的。检测了在长时间和短时间的内质网压力下应激水平的影响，结果显示MMP-26-wtE209-GFP表达细胞的IRE1α磷酸化显著少于MMP-26-GFP表达细胞，和GFP表达细胞相比没有显著差异。PERK和ATF-6在内质网压力下被激活，但是激活水平没有受到MMP-26的活性的影响。上述结果表明，MMP-26的活性是调控其内质网压力敏感性的关键因素。<br>　　为了分析MMP-26的内质网定位以及参与内质网应激是否会在生理病理进程中发挥作用，检测了内质网压力诱导因素之一并且是月经周期中的重要激素的雌激素和黄体酮对细胞內源的MMP-26蛋白水平的调控，结果显示雌激素和黄体酮均可以诱导MMP-26的细胞内蛋白水平的增加；进一步的检测黄体酮处理下MMP-26-GFP的定位，发现在黄体酮的诱导下MMP-26-GFP向高尔基体转移，表明细胞内的MMP-26在细胞稳态时定位于内质网，当月经周期中黄体酮浓度升高时，黄体酮可以诱导MMP-26分泌到细胞外基质发挥作用。<br>　　综上所述，MMP-26是一个内质网定位蛋白质，在内质网压力下向细胞外分泌，能够与GRP78相互作用并减少细胞内GRP78的蛋白水平，增加内质网压力下IRE1α的磷酸化水平，进而增加细胞对内质网压力的敏感性。同时，MMP-26的表达水平和细胞定位受到激素水平的调控。综上所述稳态条件下MMP-26的内质网定位、环境压力下的细胞外分泌以及对于内质网压力应激的调控对于其参与人体生理及病理进程至关重要。