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摘要血管内皮细胞受损与许多心脑血管疾病的发生和发展有关，已成为在当今生命科学、药学领域中重要的研究对象。心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)是世界上导致死亡的主要原因之一，通常由内皮功能障碍引发；缺乏足够数量功能正常的内皮细胞(Endothelial cells, ECs)是阻碍了通过细胞替代治疗心血管疾病的原因之一。人类多能干细胞包括胚胎干细胞(Human embryonic stem cells, hESCs)和诱导多能干细胞(Human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)可提供体外生产大量功能内皮细胞的机会，可用于移植，药物筛选或研究。然而，目前hESCs衍生ECs的分化方案多种多样，对其分化后内皮细胞类型特性的研究尚不完善，尤其是不同的分化方法以及基础培养液对于胚胎干细胞向内皮细胞分化的影响以及分化后细胞特性的区别尚未充分研究。为此本研究首先通过分离组织来源的人脐带和脐血的内皮细胞和内皮祖细胞，建立培养鉴定体系，然后通过建立多能干细胞分化为内皮细胞或内皮祖细胞的分化方案，对比不同基础分化培养液和及不同分化方法探究不同因素对分化后的分化细胞效率以及特性的影响。<br>　　1、原代内皮细胞的分离培养与鉴定<br>　　本研究首先通过了一种简便快捷、分离纯度高的人脐带动脉内皮细胞(Human umbilical cord artery endothelial cells ， HUAEC )和脐带静脉内皮细胞(Human umbilical cord vein endothelial cells，HUVEC)的分离及培养体系，同时从形态特征、增殖活力、成管能力、表面抗原和特异基因的表达等方面检测了二者在体外相同培养环境下的动态变化与差异。发现，HUAEC和HUVEC在体外连续传代培养过程中形态特征、成管能力、表面抗原(CD144、CD31、CD309、CD133、CD34)这几个方面作为内个皮细胞的基本特性没有明显差异，对于新鲜分离的HUAEC和HUVEC，两者特异性基因表达水平具有显著差异(HUAEC高表达EFNB2、DLL4、NRP1、CXCR4；HUVEC高表达EPHB4、COUP-TFⅡ)，然而随着培养时间的延长(传代次数的增加)，HUAEC丧失其特异性基因的表达(P6之后)，但HUVEC仍保持其特异性基因的高表达。因此HUVEC特异性表达基因EPHB4、COUP-TFⅡ可以作为区分体外培养的人脐带动脉或者脐带静脉来源的内皮细胞的可靠鉴定标志基因。<br>　　2、人胚胎干细胞向内皮细胞分化<br>　　本研究通过拟胚体分化法将人胚胎细胞定向分化为内皮细胞，分化后的hESCs-ECs表达内皮细胞表面抗原CD31、CD144，并在体外基质胶上能形成管状结构；StemlineⅡ(CD31+CD144+：50%-60%)作为分化基础培养液相较于之前报道较多的Stempro34(CD31+CD144+：30%)培养液具有更高分化效率；而ECM和EGM-2相较于StemlineⅡ和Stempro34分化过程中细胞活力更好，CD31表达更高(70%-80%)，但是流式分析没有明显分群现象。所有方案的内皮细胞均尚未完全确定为动脉内皮或静脉内皮细胞命运，而处于较原始内皮细胞或内皮祖细胞状态，但是可以定性为Ⅱ型内皮细胞。<br>　　3、人胚胎干细胞向内皮祖细胞分化<br>　　通过比较拟胚体分化与单层贴壁分化发现，单层贴壁分化的hESCs-EPCs形态更为椭圆，形态较为均一。贴壁分化的hESCs-EPCs成管能力显著低于拟胚体分化的hESCs-ECs。所得到的内皮细胞表现为显著高表达内皮祖细胞的标记CD133，传代后有向成熟内皮细胞分化的趋势。而且贴壁分化而来hESCs-EPCs表现更高增殖活力传代次数。与内皮细胞分化一致，所有分化方案来源的内皮祖细胞均尚未完全确定为动脉内皮或静脉内皮细胞命运，而处于较原始内皮细胞或内皮祖细胞状态，但是可以定性为Ⅱ型内皮细胞。