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摘要目的：<br>　　探讨癌因性疲乏的病因病机及辨证论治理论,提出从肝脾论治大肠癌癌因性疲乏的观点，制备化疗所致的大肠癌癌因性疲乏动物模型，验证健脾疏肝解毒治法对疲乏的治疗效果，从肠道菌群和肝脏代谢组学两个角度,探讨健脾疏肝解毒治法治疗大肠癌癌因性疲乏的可能机制。为临床治疗大肠癌癌因性疲乏提供依据。<br>　　方法：<br>　　理论研究：通过查阅古籍,汇总文献，对癌因性疲乏的西医诊疗进展进行归纳，分别从西医对该病的病因、发病机制、诊断与评估、治疗四个方面展开。继之对该病的中医病名、病因、病机、证型、中医治疗进行梳理总结。在此基础上，对从肝脾论治大肠癌癌因性疲乏的观点进行理论分析论证。<br>　　实验研究：采用荷瘤加化疗(氟尿嘧啶，缩写为5-FU)的方法构建大肠癌癌因性疲乏小鼠模型,再利用所建立的模型进行药效观察及后续的机制研究。实验采取随机分组法，共分为5组,分别为空白对照组、荷瘤组、模型组(荷瘤+5-FU)、健脾解毒组(荷瘤+5-FU+健脾解毒方)、健脾疏肝解毒组(荷瘤+5-FU+健脾疏肝解毒方)，每组包括10只小鼠。其中前三组即空白对照组、荷瘤组、模型组的设置用于评价所建立的模型是否成功。而通过模型组、健脾解毒组、健脾疏肝解毒组这三组进行比较，则可观察健脾解毒治法、健脾疏肝解毒治法对模型鼠药效的优劣，以及这两种治法作用机制的区别。除空白对照组外，其余4组均接种CT26肠癌细胞以形成肠癌移植瘤，待成瘤后开始干预。空白对照组和荷瘤组不予化疗，其余三组均给予化疗，健脾解毒组、健脾疏肝解毒组两组在给予化疗的同时，予对应的中药颗粒剂灌胃。具体给药方案为：空白对照组和荷瘤组予生理盐水0.25ml/次，腹腔注射，隔日一次，和氟尿嘧啶给药时间同步。模型组、健脾解毒组和健脾疏肝解毒组均予氟尿嘧啶20mg/kg的剂量，腹腔注射，隔日一次，连续两周。另外在此基础上，模型组用生理盐水0.5ml/次，灌胃，每日一次；健脾解毒组予健脾解毒方0.5ml/次，灌胃，每日一次；健脾疏肝解毒组予健脾疏肝解毒方0.5ml/次，灌胃，每日一次。连续干预14天,最后一次给药结束后观察1天，通过力竭游泳实验、悬尾实验等行为学检测，以及肝糖原、肌糖原等生化指标的检测对模型进行评价。之后异氟烷气体诱导麻醉，取移植瘤瘤体、左下肢肌肉、肝脏、粪便等样本进行后续分析检验。左下肢肌肉和肝脏组织用于检测其中的糖原含量，肝脏组织还用于肝脏代谢组学分析，粪便用于肠道菌群分析。<br>　　结果：<br>　　理论研究结果：<br>　　大肠癌癌因性疲乏是一种典型的身心疾病，它不仅仅是身体上的疲乏无力，还包括精神的倦怠、并能影响情感和认知功能。该病发病率高，影响患者的治疗和预后。西医对发病原因和机理尚不明晰，涉及到炎症因子、代谢紊乱、线粒体功能缺失、肌肉萎缩、免疫平衡破坏、神经内分泌系统失调、基因多态性等。该病经过睡觉放松休息等常见的舒缓措施处理无法得到缓解。目前尚无效果显著的药物和干预方法。临床上干预措施分为两类：一是药物性干预，包括中枢兴奋剂(哌醋甲酯)，终末期患者使用皮质内固醇；二是非药物性干预，包括体力活动，按摩治疗，心理社会干预、营养辅导和睡眠认知行为治疗，以及明亮白光疗法，多属于对症处理，总体疗效不佳。<br>　　中医治疗癌因性疲乏多从患者身心整体着眼，参考“虚劳”病的病因病机和治疗。综合已有的医家经验和论述，该病辨证以虚为主，以脏腑辨证为纲领，以精气血津液为经纬。虚是主要证型，当明辨五脏气血阴阳之虚，但也要兼顾虚中夹实的证候，这里的实主要指气郁，瘀血，痰浊，热毒四种以及由这四种化生的癌毒。具体到大肠癌这个癌种所致的癌因性疲乏，因其存在发病隐匿，不易早治；饮食不节，脾虚常在；情志失常，肝郁难逃；癌毒留连，虚实夹杂等特点，临床表现也和脾虚肝郁证候吻合，故提出从肝脾论治大肠癌癌因性疲乏的观点，以脾虚肝郁毒留作为该病的病机，治崇健脾益气，疏肝养肝，清解余毒。<br>　　实验研究结果：<br>　　1.模型评价结果<br>　　主要比较空白组、荷瘤组和模型组三组之间的情况。化疗开始前，各组小鼠体重、皮毛情况、饮水进食情况、精神状态、活动度等一般情况均无明显差别(P=0.667)。各组小鼠悬尾不动时间(P=0.471)、力竭游泳时间(P=0.424)也无明显差别。实验结束后，空白组小鼠的一般情况尚可，而荷瘤组、模型组的小鼠则出现毛发稀疏、不活拨、行动迟缓、进食减少、大便稀粘等现象，其中模型组更为明显。各组小鼠体重均较实验前有所增加，空白组、荷瘤组和模型组之间体重依次降低，存在统计学差异(P=0.022)，其中模型组和空白组的体重之间也存在统计学差异(P=0.006)。荷瘤组和模型组的瘤重均值分别为1.885g和0.66g，差异明显(P<0.001)。荷瘤组和模型组小鼠的力竭游泳时间较前缩短，悬尾不动时间均较前延长，模型组和空白组之间的差异有统计学意义(P<0.001)。模型组、荷瘤组、空白组小鼠肝糖原和肌糖原含量依次升高，模型组小鼠二者含量最低，和荷瘤组、空白组相比，差异具有统计学意义(P<0.001)。<br>　　2.药效观察结果<br>　　主要对比模型组、健脾解毒组和健脾疏肝解毒组三组之间的情况。实验前各组小鼠体重、皮毛色泽外观、饮水进食情况、精神状态、活动度等一般情况均无明显差别(P=0.738)。三组小鼠力竭游泳时间(P=0.879)和悬尾不动时间无明显差别(P=0.484)。实验结束后，各组小鼠体重均较实验前有所增加，模型组、健脾解毒组、健脾疏肝解毒组体重依次增加，但各组之间差异无统计学意义(P=0.553)。一般情况观察，各组均可见小鼠出现毛发稀疏、不活拨、行动迟缓、进食减少、大便稀粘等现象。模型组、健脾解毒组、健脾疏肝解毒组瘤重均值依次为0.66g、0.635g、0.511g，有逐渐减小的趋势，但是没有统计学差异(P=0.469)。三组的力竭游泳时间比实验前缩短，模型组缩短最明显，健脾解毒组比健脾疏肝解毒组力竭游泳时间短，差异存在统计学意义(P=0.011)。三组的悬尾不动时间比实验前延长。其中，模型组最长，健脾解毒组次之，健脾疏肝解毒组最短。组间两两比较，差异均有统计学意义(P<0.0.05)。模型组、健脾解毒组、健脾疏肝解毒组中小鼠肝糖原和肌糖原含量依次增高，模型组和健脾解毒组(肝糖原P=0.005，肌糖原P=0.013)、健脾疏肝解毒组相比(肝糖原和肌糖原均P<0.001)，差异均具有统计学意义。健脾解毒组和健脾疏肝解毒组之间的差异也存在统计学意义(肝糖原P=0.016，肌糖原P=0.014)。<br>　　3.肠道菌群分析结果<br>　　原始序列扩增区域338F_806R，插入片段长度400bp，测序长度PE300，原始序列数目2356505*2，总碱基数目1418616010bp。优化序列扩增区域338F_806R，样本数40，有效序列数目1692356，有效碱基数目70295722bp，序列长度分布在401至440bp之间，平均长度为415.37bp。稀释曲线走势趋于平坦。Pan/Core分析随着测序样本量数目的增加，核心OTU数目减少的幅度逐渐减小。<br>　　各组样本门、纲、目、科、属、种水平上的优势物种相同，但优势物种的丰度不同。门水平上丰度最高的优势菌门为拟杆菌门、厚壁菌门以及变形菌门。拟杆菌门分别在空白组、荷瘤组、模型组、健脾解毒组、健脾疏肝解毒组菌群中占比为20%、21%、18%、19%、22%，厚壁菌门分别为19%、19%、22%、22%、28%。纲水平上的优势菌纲为梭菌纲、拟杆菌纲、杆菌纲。梭菌纲分别为19%、21%、17%、19%、23%，拟杆菌纲分别为19%、19%、22%、22%、28%。目水平上优势菌目为梭菌目，拟杆菌目，乳杆菌目。科水平上优势菌科为毛螺菌科、拟杆菌科S24-7组、理研菌科、疣微菌科、乳杆菌科。属水平上优势菌属为拟杆菌属S24-7组、毛螺菌科NK4A136组。<br>　　空白组、荷瘤组、模型组、健脾解毒组、健脾疏肝解毒组的总共OUT数分别为624、660、664、654、671个。其中，各组共有的OUT数目为547个，占比87.67%以上，其余为特有OTU。群落Heatmap分析可见各组样本菌群在属水平上的组成和丰度不同。经过测序以及97%相似性回归之后，各组的coverage指数均大于0.99，样本的测序覆盖深度为99%以上。与模型组相比，使用健脾解毒方使可使ace指数和、chao指数和shannon指数升高，simpson指数降低，健脾疏肝解毒方作用更加明显。<br>　　样本层级聚类分析以热图展示，结果表明本研究样品分组良好。PCA分析和PCoA分析结果可见使用中药干预的两组(健脾解毒组、健脾疏肝解毒组)距离靠近，物种组成相似，和未使用中药的其他几组有明显差异。PLS-DA分析结果可见，黄色组(健脾解毒组)、紫色组(健脾疏肝解毒方)在Comp1轴上是分离的，黄色组(健脾解毒组)、紫色组(健脾疏肝解毒方)在Comp2轴上和红色组(空白组)、绿色组(模型组)分离开来，Comp1轴所代表的因素是是否所用的中药是否含有疏肝药组，Comp2轴所代表的因素是是否使用中药，可见使用健脾解毒中药和健脾疏肝解毒中药都可以影响肠道菌群组成，这种影响在二者之间也存在差异。<br>　　Lefse多级物种差异判别分析可见各组之间的肠道菌群存在差异，健脾解毒组和健脾疏肝解毒组之间也存在物种差异，其中健脾解毒组中有三种显著差异的菌种：嗜酸杆菌、厌氧菌、真杆菌和健脾疏肝解毒组不同；而健脾疏肝解毒组也有三种显著差异菌种糖化杆菌、脱硫弧菌、小月菌和健脾解毒组不同。在门水平，变形菌门在各组之间有显著差异(P=0.039)。在纲水平，脱铁杆菌纲在各组之间有显著差异(P=0.0167)。在目水平，脱铁杆菌目在各组之间有显著差异(P=0.0167)。在属和科水平，各组样本中拟杆菌S24-7组、毛螺菌的丰度靠前，在各组之间有显著差异(P<0.05)。其中健脾解毒组和健脾疏肝解毒组在科水平上丰度排名靠前的菌种丰度均有差异，其中拟杆菌的差异最明显。与本研究中测序菌群相关的主要生物学功能有多种，主要集中在碳水化合物的运输和代谢、氨基酸转运与代谢、核苷酸转运和代谢、无机物离子的转运和代谢、参与细胞膜的生物发生、复制、重组和修复、转录过程、翻译、核糖体结构和生物发生、脂质转运和代谢、次生代谢产物的生物合成，转运和分解代谢、能源生产和转化等。<br>　　4.肝脏代谢组学分析结果<br>　　各组别肝组织样本的典型GC/MS总离子流色谱图，目视检查显示出各组之间存在差异。对代谢谱的分析，本实验首先进行非监督的PCA分析，发现空白组与荷瘤组代谢谱不能很好的区分，接着再进行监督的PLS-DA分析，空白组小鼠与荷瘤组小鼠肝脏代谢物呈现较好的区分。并且该模型具有较高的解释率和预测率(两个主成份累积的解释率R2Xcum=0.72,Q2Ycum=0.66)，说明荷瘤后小鼠的代谢发生了改变。<br>　　采用交互验证的偏最小二乘法辨别分析，在荷瘤组和空白组之间建立PLS-DA模型，共找出了104个差异变量，从其中鉴定出29个代谢物分别为丁酸、缬氨酸、磷酸盐、L-异亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、2-丁烯二酸、苏氨酸、丙氨酸、苹果酸、天冬氨酸、丁酸、醋酸、谷氨酰胺、L-苯丙氨酸、磷酸、氨基乙酰丙酸、葡萄糖、D-葡萄糖酸、塔洛糖、十六烷酸、d-半乳糖、苯胺、阿司匹林、麦芽糖、1H-吲哚、七庚糖、肌醇、二十二碳六烯酸。差异代谢物在各治疗组间的变化分析发现各组两两之间均可以完全分开，同时健脾解毒组、健脾疏肝解毒组与空白组有靠近的趋势，表明健脾解毒和健脾疏肝解毒两种治法对应的中药组均可以逆转荷瘤以及化疗造模过程中造成的代谢紊乱。<br>　　对差异代谢物在各治疗组中的变化分析，结果显示模型组中有丁酸、乙酸、磷酸、氨基乙酰丙酸、苯甲胺、二十二碳六烯酸共6个代谢物有显著性差异；健脾解毒组中有磷酸酯、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、甘氨酸、2-丁烯二酸、谷氨酰胺、D-葡萄糖酸、苯甲胺、二十二碳六烯酸共9个代谢物有显著性差异；健脾疏肝解毒组中有丁酸、缬氨酸、磷酸盐、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、甘氨酸、2-丁烯二酸、L-苏氨酸丙氨酸、苹果酸、天冬氨酸、乙酸、谷氨酰胺、L-苯丙氨酸、氨基乙酰丙酸d-葡萄糖、十六烷酸、d-半乳糖、苯甲胺、阿司他林、1H-吲哚、七庚糖、肌醇二十二碳六烯酸共21个代谢物有显著性差异。可见两种不同治法的中药均有使代谢紊乱情况回归正常的趋势，健脾疏肝解毒组的效果更为明显。<br>　　代谢通路分析结果可见小鼠荷瘤后代谢途径发生改变，涉及7种重要的代谢通路：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；淀粉和蔗糖代谢；苯丙氨酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；磷酸肌醇代谢；乙醛酸和二羧酸的代谢。荷瘤小鼠给予化疗药物干预后发生改变的代谢途径涉及3条通路：丙酮酸代谢；糖酵解/糖异生代谢；卟啉和叶绿素代谢。给予健脾解毒方干预后的代谢途径改变也涉及3条通路：甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢；丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸的代谢；乙醛酸和二羧酸的代谢。给予健脾疏肝解毒方干预后代谢途径改变涉及6条通路：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；苯丙氨酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；肌醇磷酸酯代谢；乙醛酸和二羧酸酯代谢。相比健脾解毒组，健脾疏肝解毒组多出三条代谢途径，说明加入疏肝药组，能通过更多途径调整代谢紊乱。<br>　　结论：<br>　　1大肠癌癌因性疲乏可从肝脾论治，病机为脾虚肝郁毒留，治法为健脾益气、疏肝养肝、清解余毒；<br>　　2通过荷瘤或者荷瘤加化疗干预的方法均可制备癌因性疲乏小鼠模型，但应用荷瘤加化疗的方法制备的小鼠模型疲乏程度更明显；<br>　　3健脾解毒治法可改善大肠癌癌因性疲乏小鼠模型的疲乏程度及糖原水平，加入疏肝药组后效果得以提升，故健脾疏肝解毒治法效果更佳；<br>　　4健脾解毒和健脾疏肝解毒治法均可以影响大肠癌癌因性疲乏小鼠模型肠道菌群的组成和丰度，同时影响模型鼠的代谢，但二者的影响存在差别，健脾疏肝解毒法能通过更多途径逆转造模所致的代谢紊乱，这可能是其发挥治疗作用的机制之一。