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摘要背景：原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，按病理类型分为肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)、肝内胆管癌(Intrahepatic Cholangiocarcinoma，ICC)和HCC-ICC混合型[1-2]。<br>　　肿瘤的研究主要基于基因组的不稳定性，随着肿瘤分子生物学研究的深入，逐渐出现了一些新的普遍性特征。肿瘤新的标志主要包括以下6个方面：维持增殖信号，无限复制，抵抗细胞死亡，侵袭性和转移性，血管新生，逃避生长抑制因子。这6个标志都基于基因组的不稳定性[3]。1924年德国著名生物化学家﹑诺贝尔生理医学奖获得者奥托?瓦伯格(Otto Warburg)发现肿瘤的一个新标志：正常情况下，细胞中的葡萄糖通过有氧氧化途径产生ATP，但在肿瘤细胞中葡萄糖通过有氧糖酵解途径产生ATP，这就是著名的瓦伯格效应。代谢研究的兴起从一个新的维度解释了肿瘤的发生发展，是肿瘤的一个新标志[4-6]。<br>　　代谢酶的研究是肿瘤代谢中的一个热点问题，近年来肿瘤有氧糖酵解的研究一直是糖代谢研究的重点内容，而糖酵解的逆过程糖异生却很少研究。糖异生是合成葡萄糖和糖原的一个过程，主要利用一系列糖异生酶催化简单的非糖前体(乳酸、甘油、生糖氨基酸等)一步一步合成葡萄糖和糖原[7]。果糖-1,6-二磷酸酶(fructose-1,6-bisphosphatase,FBPase)是糖异生途径第二步限速反应中的关键酶，不可逆地将果糖-1，6-二磷酸催化转变成果糖-6-磷酸。人有两种基因编码的果糖-1,6-二磷酸酶，FBP1和FBP2。FBP1存在于肝肾组织中，并且是糖异生的限速酶。FBP2则只存在于肌肉组织中。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase, PCK)是糖异生反应的第一个关键酶，催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。人有两种基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，即PCK1和PCK2，PCK1存在于细胞质中，PCK2存在于线粒体中，两者都为糖异生的关键酶[8-12]。FBP1和PCK1都可以对抗肿瘤的有氧糖酵解。最近的研究表明，除了代谢调节外，这两个酶还可以通过影响转录、表观遗传学、翻译后修饰和酶活性等方面参与调控肿瘤细胞的信号转导、增殖[22]。<br>　　代谢和自噬近几年已经成为肿瘤研究的热点。自噬是一个降解细胞内蛋白质和细胞器的过程，首先细胞自身的细胞质蛋白和细胞器被囊泡逐渐包被，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，最后降解被包裹的内容物(蛋白质和细胞器)。自噬与肿瘤的关系非常密切，自噬既可以促进肿瘤细胞的死亡又可以抵抗肿瘤细胞的死亡[13-15]。已有文章证明糖异生中的关键酶葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6PC)可以调控自噬的水平，但在肝癌中FBP1调控自噬的研究还尚未报道[16-17]。<br>　　本课题首先观察了糖异生关键酶FBP1在临床肝癌组织标本、肝癌细胞系中的表达情况，通过细胞体外实验证实过表达FBP1抑制肝癌的自噬及增殖，并发现在过表达FBP1的肝癌细胞中进行低糖处理后发生明显凋亡。成功建立肝脏特异性PCK1敲除小鼠，为体内研究PCK1在肝癌中的作用机制奠定基础。上述实验将有助于我们深入了解糖异生关键酶FBP1和PCK1在肝癌发生发展中的作用，有助于从代谢角度出发为防治肝癌提供新的策略。<br>　　实验方法：<br>　　1、在TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中分析肝癌组织与癌旁组织中FBP1的表达情况，分析FBP1表达量与患者预后之间的关系。通过提取临床肝癌组织和癌旁组织标本的蛋白，利用Westernblot技术检测FBP1的表达情况。通过提取正常肝细胞和不同肝癌细胞系的蛋白，利用Westernblot技术检测FBP1的表达情况。<br>　　2.获得过表达FBP1的肝癌细胞模型。构建FBP1腺病毒重组质粒，利用AdEasy腺病毒载体系统构建过表达FBP1重组腺病毒表达载体，通过Westernblot技术鉴定FBP1重组腺病毒的过表达效率。<br>　　3．在肝癌细胞系和临床肝癌组织中分析FBP1对自噬水平的影响：利用WesternBlot技术和激光共聚焦技术观察FBP1对肝癌细胞自噬水平的影响。利用Westernblot技术检测自噬指标LC3在临床肝癌和癌旁组织中的表达情况。<br>　　4.通过体外细胞观察实验检测FBP1对肝癌细胞系增殖和凋亡的影响。通过克隆形成实验和MTS实验观察FBP1对肝癌细胞增殖能力的影响，最后通过细胞凋亡实验和WesternBlot实验检测低糖处理后FBP1对肝癌细胞凋亡的影响。<br>　　5.构建PCK1肝脏特异性敲除小鼠肝癌模型：首先用AlbCre小鼠与PCK1loxP/loxP小鼠交配获得肝脏特异性PCK1敲除小鼠(AlbCre/PCK1 loxP/ loxP),然后用二乙基亚硝胺/四氯化碳诱导小鼠肝癌模型，从而观察PCK1敲除对小鼠肝癌发生发展的影响。<br>　　结果：<br>　　1.TCGA数据库分析发现，肝癌组织中FBP1的表达与癌旁组织相比明显降低(P<0.01)，并且HCC患者中低表达FBP1的患者生存期显著低于高表达FBP1的患者。Westernblot结果发现12对肿瘤组织标本中有9对FBP1蛋白表达呈下调趋势，占66.6%。Westernblot结果发现在肝癌细胞中FBP1的表达低于正常肝细胞。<br>　　2.成功构建FBP1腺病毒重组质粒，并包装成高滴度腺病毒，Westernblot方法鉴定FBP1重组腺病毒构建成功。<br>　　3.WesternBlot结果显示，过表达FBP1的肝癌细胞自噬指标LC3的水平明显降低。激光共聚焦检测结果表明，过表达FBP1的肝癌细胞的自噬体数量明显下降。9对FBP1低表达的肝癌组织标本中有8对自噬指标LC3的水平高于癌旁组织。<br>　　4.MTS实验和克隆形成实验结果显示，过表达FBP1的肝癌细胞其增殖能力明显被抑制，WesternBlot实验和细胞凋亡实验结果显示，低糖处理后过表达FBP1组的肝癌细胞发生明显凋亡。<br>　　5.成功构建PCK1肝脏特异性敲除小鼠肝癌模型。<br>　　结论：<br>　　在本研究中，我们首先发现了FBP1在肝癌组织中低表达，然后在细胞体外实验中证明FBP1可以抑制肝癌细胞的自噬及增殖，并证明过表达FBP1促进肝癌细胞的凋亡。成功构建PCK1肝脏特异性敲除小鼠肝癌模型，并证实PCK1敲除能促进肝癌的发生发展。